黄花苜蓿(Medicago falcalta L.)是一种耐寒性极强的优良豆科牧草。本文根据本实验室庞朝枢构建的“黄花苜蓿冷诱导消减文库”里筛选得到的金属蛋白酶(filamentation temperature-sensitive H，MfFtsH)基因的主体片段，克隆出该基因编码区全长。通过半定量RT-PCR技术，分析这个基因的内生日节奏性表达，以及在温度胁迫、盐胁迫、脱水胁迫和ABA处理条件下的表达规律，同时还探讨了紫花苜蓿中的同源基因在低温下的表达规律。构建了pBI-MfFtsH超表达载体，通过农杆菌介导转化烟草，得到转基因烟草植株，为进一步开展坳MfFtsH的功能研究奠定基础。论文获得以下主要研究结果： 1.黄花苜蓿MfFtsH基因的克隆 设计特异引物，通过RT-PCR从冷诱导处理的黄花苜蓿cDNA中克隆得到MfFtsH基因。克隆得到的MfFtsH长2304 bp，开放阅读框2127 bp，编码709个氨基酸的蛋白。用ClustalX 1.8软件对MfFtsH与其它几种常见植物的FtsH氨基酸序列进行同源分析，结果显示MfFtsH与紫花苜蓿(Medicago sativa)的FtsH相似性(identities)最高，达到99％，与番茄(Solanum lycopersicum)、烟草(Nicotiana tabacum)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)的相似性分别是82％、82％和81％。通过亚细胞定位分析，预测MfFtsH可能是一种定位于叶绿体上的蛋白。 2.MfFtsH基因的表达分析 MfFtsH基因在正常条件下的表达具有明显的内生节奏性：其表达呈递增趋势并于15点左右达到1d中的最大值，然后该基因表达量逐步下降。MfFtsH在低温处理后，在短时间内迅速响应，表达量逐渐上调，3 d后达到最大；盐处理则能在短时间内(4 h)迅速诱导坳MfFtsH的表达，1-2d内都维持较高水平的表达，3d后开始逐渐回落；脱水处理后的坳MfFtsH的表达量在短时间内迅速提高，4h后达到较高水平，随后有所下降但也保持在较高的水平；高温胁迫和外源ABA处理下，MfFtsH在短时间内表达量显著上调，然后下降到正常水平。在紫花苜蓿中，FtsH的同源基因也会受冷诱导表达，但响应速度不及黄花苜蓿快，表达量也较少，说明该基因与黄花苜蓿的抗逆生理关系密切。 3.MfFtsH基因转化烟草 构建了pBI-MfFtsH超表达载体，通过农杆菌介导法转化烟草，PCR和Southern杂交分析的结果表明，MfFtsH插入了转基因烟草基因组中，并且这些转化植株是来自不同的转化事件，同时发现转基因植株在外观形态和生长情况方面与野生型没有差异。以上工作为进一步研究MfFtsH的生理功能奠定了前期基础。