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对人类危害巨大的季节性流感主要由H1N1和H3N2亚型流感病毒引起,两种亚型病毒常合并在一起感染流行；另一方面,近年来在不同地区爆发禽流感主要由H5N1和H9N2亚型感染引起,并正在跨越种族界限,从禽类直接感染人,引起极高的死亡率。由于各种亚型流感病毒所致疾病的治疗和防控策略不同,建立可以同时进行H1、H3、H5、H9四种亚型病毒检测和分型的快速检测方法,对于流感的早期诊断和制定有效防治策略有重要意义。本论文围绕H1、H3、H5、H9四种亚型流感病毒同步快速检测和分型方法的建立,以及两株H5N1亚型禽流感病毒地方分离株的生物学特性开展研究,取得了以下成果：1.采用SPF鸡胚扩增了H1N1、H3N2、H5N1和H9N2四种亚型流感病毒,测定了四种亚型流感病毒的EIDso和血凝效价,计算了病毒的滴度。2.从NCBI数据库中下载了H1、H3、H5、H9以及M基因的序列,用CLUSTALX软件比对分析,找出各亚型的保守序列,优化设计了适合四种亚型病毒HA基因和A型流感病毒M基因同步扩增的多重RT-PCR检测引物。通过摸索与优化实验条件,建立了A型流感病毒H1、H3、H5、H9亚型同步检测分型的多重RT-PCR检测方法。A型流感病毒检测产物为239bp,对应于H1、H3、H5、H9亚型分型的检测产物的大小依次为612bp、189bp、338bp和289bp。3.以H1N1、H3N2、H5N1和H9N2亚型流感病毒基因组RNA为模板,RT-PCR扩增HA基因片段,将其分别克隆到pMD18-T载体上,转化E. coli DH5α。斑筛选阳性克隆,提取质粒进行酶切鉴定和测序分析,得到重组质粒pMD18-H1、 pMD18-H3、pMD18-H5和pMD18-H9,用于多重RT-PCR方法的灵敏度分析。4.对该检测方法的敏感性和特异性进行了分析。敏感性分析结果显示,对应于病毒RNA的检测限分别是H1、H3、H5亚型均为1ng,对应于H9亚型为0.1ng。将该检测方法检测结果与传统鸡胚接种及病毒分离鉴定方法进行比较。对检测出的阳性样品进行病毒培养和基因测序分析,所建立多重RT-PCR检测分型结果与病毒分离测序结果一致,表明该方法具有良好的特异性和敏感性。5.将所建立的多重RT-PCR流感病毒检测分型方法应用于禽源疑似样品检测,对H5N1阳性组织进行病毒鸡胚扩增和分离鉴定,从鹌鹑和鸭体分离到两株高致病性H5N1亚型禽流感病毒,分别命名为A/Quail/Nanchang/02/2013(H5N1)和A/Duck/Nanchang/01/2013(H5N1).经有限稀释法分别对两株病毒进行空斑克隆与纯化,RT-PCR扩增了两株病毒的HA和NA基因,对其进行测序分析,构建了系统进化树,初步确定了与已报道相关毒株的亲缘关系。6.对A/Quail/Nanchang/02/2013(H5N1)和A/Duck/Nanchang/01/2013(H5N1)两株禽流感病毒的细胞增殖特性和小鼠致病性进行初步研究,初步证实两株H5N1禽流感病毒在小鼠致病性上的差异性。以上结果为研制H1、H3、H5、H9四种亚型流感病毒检测和分型的快速检测试剂盒,以及认识H5N1禽流感病毒的跨种传播机制奠定了基础,对提高人禽流感的防控水平有重要的意义。