酱油口感醇厚、鲜咸适口,是人们餐桌上必不可少的调味品,其发酵关键菌株是米曲霉3.042。我国酱油酿造主要采用低盐固态和高盐稀态两种发酵工艺,盐可以抑制杂菌生长,防止酱醅腐败变质。但该环境条件会抑制米曲霉生长,截至目前,鲜有米曲霉盐胁迫机制的相关研究;同时,盐环境中蛋白酶活性被抑制,导致原料水解不彻底,发酵周期被延长,因此耐盐蛋白酶的纯化很有必要。故本文利用蛋白质组学手段,解析米曲霉潜在的盐胁迫机制。且利用不同层析技术从酱油大曲中分离纯化耐盐蛋白酶,测定其酶学性质。本文的主要结果如下:基于串联质量标签（Tandem Mass Tags,TMT）方法的比较蛋白质组学分析,米曲霉3.042在盐胁迫下,共鉴定4748个蛋白,定量4381个蛋白,固体培养时筛选到458个差异蛋白,液体培养时筛选到199个蛋白。差异蛋白涉及碳水化合物代谢、脂质代谢、氨基酸代谢、脂肪酸代谢、维生素代谢、核酸代谢、甲烷代谢、蛋白质内质网修饰以及其他一些代谢通路,包括MAPK信号通路和线粒体自噬等。还有部分差异蛋白属于肽酶、氧化还原酶、水解酶、细胞壁蛋白以及转运蛋白等。根据差异蛋白的功能和参与的代谢通路,得到米曲霉3.042潜在的盐胁迫机制,包括:（1）盐胁迫将MAPK-Hog1介导的HOG-MAPK信号传导途径激活,调节甘油合成,缓解菌体的渗透压胁迫;（2）菌体在盐环境中培养时,渗透性溶质甘油、脯氨酸、谷氨酸以及谷胱甘肽显著上升,以缓解压力胁迫,并防止Na⁺进入细胞对菌体细胞的毒性;（3）盐环境中K⁺通道蛋白、K⁺转运蛋白以及部分提供能量的激酶均显著上升,将K⁺转运至胞内,提高胞内渗透压,以保护菌体免受Na⁺的损害;（4）盐胁迫激活钙调磷酸酶信号传导途径,进而做出盐胁迫应答。这为米曲霉盐胁迫反应分子机理研究和工业微生物性状改造提供理论基础。采用硫酸铵沉淀、Q-HP阴离子交换柱和Superdux 75凝胶柱等技术,从酱油大曲中纯化得到一种耐盐蛋白酶,经飞行时间质谱鉴定为钙蛋白酶RIM13,该蛋白酶首次从酱油大曲中分离得到,是一种半胱氨酸蛋白酶。钙蛋白酶RIM13的最适温度50?C,稳定温度40?C,最适pH 6.5,稳定pH 7.0;Fe³⁺、Fe²⁺、Cu²⁺、Ca²⁺、K⁺和Na⁺抑制蛋白酶酶活,Mn²⁺促进蛋白酶酶活,以上金属离子对蛋白酶的二级结构均产生不同程度的影响;该蛋白酶的米氏常数Km为2.43 g/L,最大反应速率Vm为103.09 mg/（L·min）;该蛋白酶在5%、10%和15%的盐度下,相对酶活分别保留77.22%、54.39%及41.15%。以上酶学性质表明,该蛋白酶适合应用于酱油发酵,为耐盐蛋白酶在酱油发酵中的应用提供理论支持。