超广谱β—内酰胺酶(ESBLs)尤其是blaCTX—M型ESBLs和质粒编码的AmpC酶(pAmpC)是介导第三代头孢菌素耐药的主要机制。质粒介导的喹诺酮耐药(PMQR)是近年来出现的一种介导氟喹诺酮类药物低水平耐药的机制。临床上对第三代头孢菌素耐药的大肠杆菌可能由于耐药基因的连带筛选而表现为对氟喹诺酮类药物耐药的现象得到了广泛关注。然而，关于动物源尤其是宠物源大肠杆菌中ESBLs和PMQR的研究报道较少。本文旨在了解头孢噻呋耐药食品动物源和宠物源大肠杆菌中ESBLs和PMQR基因的流行情况，探讨这两类基因在菌群中的传播机制，以期为兽医临床合理应用头孢菌素类和喹诺酮类药物提供依据，并为了解食品动物源和宠物源细菌的耐药背景及评价第三代头孢菌素和氟喹诺酮类药物在兽医领域使用的风险性打下基础，同时也为控制耐药菌的扩散传播提供思路。 ⑴头孢噻呋耐药大肠杆菌ESBLs、pAmpC和PMQR基因的检测。采用PCR方法对5组blaCTX—M型ESBLs基因(blaCTX—M—1G，blaCTX—M—2G，blaCTX—M—8G，blaCTX—M—9G和blaCTX—M—25G)、blaTEM、blaSHV、 pAmpC基因(blaCMY—2和blaDHA—1)和PMQR基因(qnrA、qnr、qnrS、aac(6')—Ib—cr、和qepA)进行检测，从412株头孢噻呋耐药动物源肠杆菌科细菌中检测到blaCTX—M—1G102株(24.8％)，blaCTX—M—9G245株(59.5％)，同时产blaCTX—M—1G和blaCTX—M—9G的有38株(9.2％)，blaCMY—224株(5.8％)，blaDHA—125株(6.1％)，qnrA、qnrB、qnrS、aac(6')—Ib—cr和qepA分别是2株(0.5％)、18株(4.4％)、3株(0.7％)、37株(9.0％)和18株(4.4％)。不同来源菌株检测以上耐药基因检出率存在差异。经测序确定blaCTX—M—1G基因以blaCTX—M—55为主，blaCTX—M—9G以blaCTX—M—24和blaCTX—M—27为主。研究结果表明我国广东地区动物源大肠杆菌主要流行的是blaCTX—M型ESBLs基因，且以blaCTX—M—1G和blaCTX—M—9G基因为主；PMQR基因在两种不同来源细菌中的分布有一定差异，以aac(6')—Ib—cr、qnrB和qepA基因为主。 ⑵头孢噻呋耐药大肠杆菌的系统进化性分析。采用PCR及测序方法分析头孢噻呋耐药大肠杆菌的系统进化关系，结果表明主要是属于系统进化组别的A组和D组，其次是B1组，B2组检出率最低。blaCTX—M型ESBLs和blaCMY—2阳性大肠杆菌主要分布于A组和D组；blaDHA—1、qnrB、qnrS和aac(6')—Ib—cr阳性株主要分布在A组和B1组。 ⑶btaCTX—M型ESBLs和PMQR基因的传播机制研究。采用脉冲场凝胶电泳(PFGE)、肠杆菌科保守重复序列聚合酶链式反应(ERIC-PCR)、接合实验等方法分别从垂直克隆传播和水平传播两方面研究blaCTX—M型ESBLs和PMQR基因的传播扩散机制。PFGE分型结果表明，随机挑选95株blaCTX—M型ESBLs菌株，有80株成功分型的菌株可以分为69种不同的PFGE型；随机挑选36株PMQR阳性菌株进行ERIC-PCR分型，结果34株PMQR阳性株分型成功，可以分为28个不同的ERIC-PCR型，说明广东局部地区的ESBLs和PMQR阳性株具有多样性且均存在散发的克隆传播。以E.coli C600+和J53AziR为受体菌进行ESBLs和PMQR基因的接合实验，结果得到46株ESBLs接合子和5株PMQR接合子，提取接合子质粒发现ESBLs和PMQR位于≥80kb的可接合性质粒上。此外，对接合子质粒进行酶切，发现不仅同一养殖厂内存在酶切图谱一致的ESBLs基因阳性质粒，而且食品动物源和宠物源菌株间也存在酶切图谱一样的qnrB基因阳性质粒，提示耐药基因的扩散与质粒的水平传播有关。这些结果充分说明了广东地区动物源肠杆菌科细菌中ESBLs和PMQR基因的流行是耐药菌的克隆传播和耐药质粒的水平转移共同造成的。 ⑷qnrB、aac(6')—Ib—cr和blaCTX—M—14基因环境分析及ESBLs、PMQR阳性质粒的复制子分型研究。采用质粒酶切、大片段随机连接、定向克隆以及引物步移法分析qnrB、aac(6')—Ib—cr和blaCTX—M—14的基因环境，并用Gene construction kit2软件分析目的基因周边的基因环境。结果显示，qnrB6位于两个ISCR1之间，其上游是qacE△1和sull，下游是dfr基因和ISCR1元件；aac(6')—Ib—cr位于复杂的Ⅰ类整合子的可变区内，其上游是Ⅰ类整合酶基因intI1和Tn1696转座子，下游是aar—3、qacE△1和sull；blaCTX—M—14的上游序列依次是ISEcp1(部分序列)和两个未知序列(其中约500bp是大肠杆菌致病性序列)，下游是IS903D(部分序列)和Tn1721(被截断的)，与已报道的人医临床菌株相对应的基因具有较为相似的基因骨架结构，提示与这些结构相关的一些元件在介导这些耐药基因的扩散方面具有重要作用。采用PCR方法对接合子质粒进行复制子分型研究，结果表明动物源blaCTX—M型ESBLs质粒主要属于IncFⅡ和IncN型质粒。 ⑸产blaCTX—M型ESBLs是广东地区食品动物源和宠物源肠杆菌科细菌对第三代头孢菌素类药物耐药的主要机制，耐药菌株的克隆传播和耐药质粒的水平传播共同造成的，且以质粒的水平传播为主，是造成广东地区动物源大肠杆菌对第三代头孢菌耐药严重耐药的主要因素；两种来源的肠杆菌科细菌中均存在PMQR基因和pAmpC基因，应该得到进一步的研究和关注；插入序列(ISCR1、ISEcp1和IS903D)及转座子(Tn1969和Tn1721)可能与qnrB6、aac(6')—Ib—cr和blaCTX—M—14基因的扩散有关。应积极开展头孢菌素类药物和氟喹诺酮类药物在兽医临床使用的安全评估工作，制定这两类药物在兽医临床合理使用的规程，更好地发挥其在抗感染治疗中的重要作用及延长这两类药物的使用时间。