实验背景:随着科学技术进步,经济行业变革,人类生活水平逐步提高,出行更加便捷,饮食质量不断改善,同时单纯体力活动较前减少,人体内热量堆积形体肥胖,所致后果就是心血管事件的发病率、致死率不断攀高。对于有效预防,及时诊断,减少并发症就成为心血管研究领域的聚焦点。经皮冠状动脉成形术对及时畅通发生急性缺血事件的罪犯血管,挽救濒死心肌无疑带来了革命性的希望,但是缺血的心肌经血液复流后,就会产生再灌注损伤,这已经成为阻碍冠心病救治的一道沟壑。已有大量研究表明缺血/再灌注(myocardial ischemia/reperfusion,I/R)损伤心肌线粒体出现了Ca2+超载现象,同时Ca2+超载又是诱发心肌细胞凋亡的重要因素之一。Ca2+摄取蛋白1(mitochondrial calcium uptake 1,MICU1)是线粒体的内膜蛋白,可以调节Ca2+转运,防止线粒体内出现Ca2+超载发生。真核细胞的线粒体内含有1000余种蛋白质,约99%是由细胞质核糖体合成后经线粒体外膜上线粒体外膜转位酶(translocase of the outer mitochondrial membrane,TOM)复合物的运输,转运到线粒体内部,分别定位于基质、内外膜或膜间隙等部位后发挥其相应的生理功能。线粒体外膜转位复合物亚基70(translocaseoftheoutermembrane70,tom70)是tom复合物的主要受体蛋白之一,主要识别前体蛋白,其带有整合定位信号。最新研究发现蛋白激酶a可以对tom70进行磷酸化的调节,从而发挥制约其受体表达的作用,同时与帕金森疾病、病毒性丙型肝炎和糖尿病视网膜病变等的发病有关。越来越多的研究发现,线粒体内外膜蛋白在心脏的缺血性损伤中发挥着重要作用,通过调节这些线粒体膜蛋白就能起到改善线粒体耐受缺血,抑制损伤扩大,对心肌细胞生存起到有效的保护作用,维持心肌细胞形态稳定和功能正常表达。i/r导致心肌线粒体损伤,其内外膜蛋白micu1和tom70的表达是否受到抑制;是否能够通过调节micu1表达抑制线粒体ca2+超载,减轻i/r心肌损伤;tom70是否能够调节micu1蛋白的表达;tom70是否能够通过增加micu1的线粒体转位,抑制线粒体ca2+增加,从而减轻mi/r损伤,这些机制尚不清楚。本研究将通过动物实验阐明线粒体功能蛋白tom70/micu1在mi/r中的作用并探讨其机制,为有效治疗冠心病提供新机制研究基础。实验目的:1.观察mi/r损伤对线粒体功能蛋白micu1与tom70等的影响;2.研究micu1在小鼠mi/r损伤中的作用;3.研究tom70与micu1的调节关系;4.研究tom70对mi/r损伤的影响及其内在机制。实验方法:1.心肌线粒体功能蛋白tom70和micu1表达下调和/或上调小鼠模型的建立:利用2%异氟烷麻醉小鼠后,在操作台上固定,经小鼠左侧第4、5肋间隙充分暴露心脏,然后进行心肌点注射20μgtom70sirna、micu1sirna或scrambledsirna,制备tom70、micu1表达降低的小鼠模型;此外,经同样方法,将载有tom70片段慢病毒进行心肌点注射,建立tom70和micu1表达升高小鼠模型;2.mi/r小鼠模型的建立:经心肌点注射72小时后,通过结扎小鼠的心脏冠状动脉左前降支30min给予缺血处理;之后打开活结使血管再通血液复流3h,建立mi/r损伤动物模型,然后处理各组小鼠;3.缺血心肌再灌注3小时之后(1)利用westernblots方法检测心肌线粒体中tom70、micu1蛋白的表达水平;(2)根据免疫组化的操作步骤来检测小鼠心肌组织中tom70蛋白的表达;(3)根据免疫荧光的操作步骤来检测小鼠心肌组织micu1蛋白的表达;(4)应用tunel染色技术和caspase-3检测试剂盒来测定心肌细胞凋亡情况;(5)经透射电镜观察小鼠心肌线粒体结构形态破损情况;(6)利用atp试剂盒检测atp生成水平,来了解心肌线粒体功能变化;(7)采用jc-1试剂盒测定线粒体膜电位水平,来了解心肌线粒体功能变化;(8)利用原子火焰吸收法检测小鼠心肌线粒体内ca2+量变化情况;4.缺血心肌再灌注24h后(1)采用小动物超声系统,检测小鼠心脏的功能变化情况;(2)待心脏功能检测后将小鼠冠脉的左前降支再次结扎,利用evansblue/ttc染色方法的操作,按照步骤要求检测各组小鼠心肌梗死面积变化情况。实验结果:1.将线粒体的膜和嵴结构变化、atp生成水平、膜电位和内部ca2+量变化作为评价线粒体形态和功能检测指标。结果发现,与正常小鼠相比,经i/r处理后的小鼠心肌线粒体形态大小不一,线粒体膜破裂,线粒体嵴断裂、紊乱模糊不清晰等;线粒体生成atp水平、膜电位水平较正常小鼠降低,线粒体内部ca2+量较正常小鼠升高;同时,经i/r处理后心肌线粒体micu1和tom70蛋白的表达出现下降。经i/r处理后,心肌线粒体功能受到抑制,形态遭到破损,线粒体内出现ca2+超载,表明心肌细胞在亚器官水平出现损伤,并且与线粒体内部物质转运相关的内外膜功能蛋白micu1和tom70表达也有所下降。2.与正常组小鼠比较:micu1蛋白表达降低小鼠在心肌组织免疫荧光和心肌线粒体westernblot检测方面显示,micu1蛋白表达明显降低。与mi/r正常组小鼠相比,血液再灌注3h后,micu1蛋白表达降低小鼠的心肌组织经tunel技术染色观察,作为阳性指标的绿色细胞数量有所增加,caspase-3活性测定显示其检测值增高,说明心肌细胞凋亡增加;心肌线粒体结构形态破损,atp生成量减少,膜电位水平降低,原子吸收法检测线粒体内ca2+量增加,说明micu1蛋白表达降低小鼠的心肌在亚细胞器官水平损伤的增加;再灌注24h之后,micu1蛋白表达降低增加了i/r小鼠的心肌梗死面积,同时心脏功能也出现进一步的下降。3.与正常组小鼠比较:tom70蛋白表达降低/升高小鼠在心肌免疫组化和心肌线粒体Western blot检测方面显示,Tom70蛋白表达出现相应的降低/升高。与MI/R正常组比较,血液再灌注3h后,Tom70蛋白表达降低小鼠在Western blot检测MICU1蛋白的表达出现降低;Tom70蛋白表达升高小鼠Western blot检测心肌线粒体MICU1蛋白表达增加,但这种升高效应可通过降低MICU1蛋白表达而被抑制。这表明线粒体外膜转运蛋白受体Tom70和线粒体内膜MICU1蛋白具有相关性;进一步通过免疫共沉淀检测发现Tom70与MICU1两种蛋白发生直接作用,表明MICU1蛋白是通过与线粒体TOM复合物受体蛋白Tom70的结合被转运至线粒体内,进而发挥其作用的。4.与MI/R正常组小鼠对比,Tom70蛋白表达降低小鼠由宏观到微观的检测显示,心脏功能受到抑制,心肌梗死面积增加,心肌细胞凋亡水平升高,线粒体形态破损和嵴断裂、消失程度增加,线粒体膜电位和ATP水平降低,线粒体内Ca2+量增加;Tom70蛋白表达升高小鼠较MI/R正常组小鼠则可以改善上述指标检测结果,使得增强心脏功能,减少心肌梗死面积,降低了心肌细胞凋亡水平,降低了线粒体膜破裂和嵴断裂、消失损伤程度,升高线粒体ATP和膜电位水平,减少线粒体内的Ca2+量;但是这些检测指标结果的改善,可因MICU1表达降低而受到抑制。表明Tom70通过调节线粒体MICU1的表达,来减轻由于I/R造成心肌损伤程度。实验结论:1.I/R增加心肌线粒体损伤,减少线粒体功能蛋白Tom70与MICU1表达;2.MICU1能够抑制线粒体Ca2+超载,进而减轻MI/R损伤;3.Tom70能够调节MICU1向线粒体内的转位;4.Tom70通过增加MICU1的线粒体转位抑制线粒体Ca2+超载而减轻MI/R损伤。