基于Nrf2/ARE信号通道研究槲皮素磷脂复合物对氧化损伤视网膜色素上皮细胞的保护作用

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目的:合成槲皮素磷脂复合物,以ARPE-19为研究对象,比较槲皮素及其磷脂复合物对t-BHP诱导ARPE-19细胞氧化损伤的保护作用;观察槲皮素及其磷脂复合物对Nrf2/ARE信号通道及下游Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶的调控作用,阐明槲皮素保护氧化损伤细胞的机制。方法:采用溶剂法制备复合物,差示扫描量热分析、红外光谱分析、X-射线衍射分析进行表征;测定单体及其复合物在水/氯仿中的溶解度。用t-BHP诱导ARPE-19细胞氧化损伤,MTT、AnnexinV-FITC/PI检测槲皮素及其磷脂复合物对细胞存活率、凋亡率的影响。将ARPE-19细胞分成:溶媒对照组(DMSO)、氧化损伤组、Nrf2 siRNA组、药物干预组、Nrf2siRNA+药物干预组,荧光定量PCR检测各组ARPE-19细胞Nrf2、HO-1、NQO-1、GCL、mRNA转录,Western blot检测各组ARPE-19细胞核内Nrf2、胞质Nrf2、HO-1、NQO-1、GCL蛋白表达,分别用二氯荧光黄法、化学比色法、黄嘌呤氧化酶法和硫化巴比妥酸法测定细胞内ROS、T-AOC.SOD、MDA含量。结果:差示扫描量热分析、红外光谱分析、X-射线衍射分析结果显示槲皮素与磷脂复合后形成一种新的化合物;与槲皮素相比,复合物在水中的溶解度为原药的3倍,在氯仿中的溶解度增加更明显。终浓度为100μmol/L、200μmol/L和400μmol/L的槲皮素磷脂复合物与相同浓度的槲皮素比,氧化损伤细胞的存活率均更高,凋亡率更低。荧光定量PCR、Western blot检测结果显示,氧化损伤细胞NRF2、HO-1、NQO-1、GCL的表达增加,但在NRF2 siRNA细胞则增加幅度减少;槲皮素及其磷脂复合物能明显上调NRF2、HO-1、NQO-1、GCL表达,且槲皮素磷脂复合物作用比单体更强,NRF2 siRNA+药物干预时上调作用减弱。氧化损伤细胞的SOD活性明显降低,MDA、ROS大幅增加,T-AOC显著降低,槲皮素及其磷脂复合物能起到逆转作用,且槲皮素磷脂复合物作用强于单体,但在NRF2 siRNA细胞作用减弱。结论:槲皮素与磷脂复合后能明显提高原药的水溶性和脂溶性;槲皮素磷脂复合物对氧化损伤ARPE-19细胞的保护作用优于槲皮素单体;槲皮素保护氧化损伤ARPE-19细胞的作用可能是通过激活Nrf2/ARE信号通道,上调下游Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶的表达来实现。
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