养猪业是我国的传统产业，生猪的存栏量和出栏量均占世界第一。但近年来，我国养猪业的传染病愈来愈复杂，在众多的病因中，病毒引起的疾病首当其冲，如猪瘟、传染性胃肠炎、伪狂犬等。疫苗由于免疫程序、运输、使用等各方面的原因使得部分病毒性传染病无法用疫苗控制，而且疫苗对传染病没有治疗作用。因此，积极预防和治疗猪病毒病一直是政府和企业共同关注的问题。干扰素(Intefferon，IFN)具有广谱抗病毒、抗肿瘤及免疫调节等多种生物学功能。目前，已有一些基因工程干扰素产品，在防制人类和动物的病毒性疾病上起到了意想不到的效果。因此，本实验对猪a干扰素进行研究，旨在能将之用于预防和治疗猪的病毒性疾病。 根据猪a干扰素的核苷酸序列，设计并合成了一对引物P1/P2，根据该基因的酶切图谱和表达载体多克隆位点的分析，在上游引物P1中加入了限制性内切酶EcoRI，在下游引物P2中加入了限制性内切酶XbaI；为得到表达的融合蛋白，设计下游引物时，切除了猪a干扰素基因的终止密码子，并注意调整猪a干扰素基因和其后融合的载体序列的阅读框架的正确。为进行目的蛋白的分泌表达，本实验采用了毕赤酵母表达载体的a因子信号肽。此信号肽能引导目的蛋白离开细胞，分泌于培养基中，方便蛋白质提取与纯化。 从原核重组表达质粒pET-IFN中扩增猪a干扰素基因完整的开放阅读框架(ORF)，扩增长度为501bp。将目的片断与表达载体pPICZaC分别经过EcoRI和XbaI双酶切，然后连接转化大肠杆菌，得到重组表达质粒pPICZaC-IFN，送上海博亚公司测序鉴定。结果显示目的基因完整ORF已经正确插入表达载体pPICZaC。重组表达质粒pPICZaC-IFN经SacI单酶切电泳后，纯化回收，电击转化感受态的毕赤酵母工程菌X33，转化菌液用冰山梨醇温育培养30分钟，涂布YPDS+ZeocinTM选择性培养基，置28℃温箱培养4～5天，结果获得多个单菌落。通过提高抗生素浓度，筛选出具高抗性的转化子。先用BMGY培养基(含甘油)激活培养约24小时，OD值达2～6。收集菌液，3000转/分钟离心2分钟，弃上清。用BMMY培养基(含甲醇)重悬菌体，置摇床28℃、250转/分钟诱导表达。每24小时添加一次甲醇，保持终浓度1.0％。诱导表达4天后，收集菌液，离心，取上清。取少量上清液进行SDS-PAGE电泳分析，可见一条分子量约19.4KDa清晰蛋白条带，与理论值相符，而空载体转化宿主菌的对照未发现特异的蛋白条带。表达产物进行Western-blotting分析，显示在19.4KDa处出现了一条特异的显色条带，表明表达产物是猪的a干扰素。 取上述甲醇诱导表达后的上清液，先进行无菌检验，然后用DMEM4倍稀释成不同浓度后，移入预先培养好的Vero96孔细胞培养板，每孔100微升。每个浓度作6个重复，同时设置细胞对照和病毒对照，不加干扰素。培养过夜。用100微升TCID50VSV攻毒，细胞对照孔不加病毒液。37℃、5％CO2条件下培养约24小时至36小时。待病毒对照孔出现完全细胞病变时，判断结果，并根据细胞的病变程度，按5分级制进行打分。50％细胞病变保护的稀释度中所含的干扰素量即为1个干扰素单位。 结果显示本研究成功地在毕赤酵母中表达出猪a干扰素，该表达蛋白能够干扰VSV病毒在Vero上的复制，表明该蛋白在预防和治疗猪病毒性疾病方面具有潜在的应用价值。