胆管癌是消化系统重要的恶性肿瘤。其恶性度高、诊治困难、预后不良，严重威胁人类的健康。目前认为，根治性手术切除是胆管癌惟一有效的治疗手段。尽管近年来诊疗技术有了较快发展，但其5年存活率仍然只有5％左右，主要原因是术后极易复发。浸润和转移是恶性肿瘤重要的生物学特性，也是肿瘤重要的预后因素之一。传统认为，恶性肿瘤的转移途径主要有四种：局部浸润、血道转移、淋巴转移和腹腔广泛种植。胆管癌除具有以上四种转移途径外，还具备一种重要而较为特殊的转移方式，即沿神经鞘膜下的间隙，发生神经浸润和转移。一方面，神经浸润多发生于腹膜后神经丛，位置深在且范围广泛，常包绕动静脉等重要解剖结构，难于术前诊断及乎术治疗，是胆管癌术后易于复发的重要原因之一；另一方面，对于神经侵犯的唯一治疗手段是广泛的软组织清扫，这不仅增加了手术创伤，而且广泛的神经丛清扫，易致患者术后顽固性腹泻，对于高发于老年人的胆管癌的治疗极为不利。因此，胆管癌神经浸润成为困扰胆管癌临床治疗的棘手问题。该问题已经引起临床医生的高度重视，但是由于其机理不明，故治疗方法的探索大多停留于扩大手术切除范围上。但是临床研究证实，即使采用附带血管重建和肝脏切除的“治愈性切除”（curative resection），仍然无法显著提高患者的远期存活率。于是众多学者面临这样的思考：能否将目光转向神经浸润的发生机理，从机理入手寻找诊治的突破口呢?目前的研究显示，多种细胞因子参与肿瘤的神经浸润和转移过程，神经生长因子（Nerve Growth Factor，NGF）可能是其中极为重要的一员。在邹声泉教授的领导和悉心指导下，我们的课题组已经对胆管癌的生物学特性进行了一系列的研究，特别是在临床流行病学、表遗传学、病原学等方面取得了一些阶段性成果。本研究旨在前期研究结果的基础上，对胆管癌的神经浸润和转移的生物学特性进行初步的研究和探索，着重探讨神经生长因子在此过程中的作用，以期能够为临床治疗研究提供备选分子靶点，并对这一较为特殊的现象有所认识和总结。第一部分：神经生长因子与胆管癌临床病理特征的相关性分析论文1：胆管癌神经浸润的临床病理分析目的总结分析胆管癌神经浸润的临床病理特点，与腹痛或背痛、淋巴转移、病理类型以及肿瘤分期的关系。方法回顾性分析我院和河北医科大学第四医院1998年1月至2003年12月手术切除的92例胆管癌标本的临床病理资料。Spearman’s等级相关检验神经浸润与疼痛、淋巴道转移、病理分型以及肿瘤分期的关系。结果1．92例胆管癌中，神经浸润阳性者35例，其中有腹痛或背痛主诉者11例；神经浸润阴性57例，有腹痛或背痛主诉者22例。神经浸润与疼痛之间无显著相关性，但是疼痛与胆管癌TNM分期显著相关。2．神经浸润阳性组中，低分化胆管癌占62.9％（13/60）；神经浸润阴性组中，低分化胆管癌占17.5％（10/57）。神经浸润与低分化正相关，神经浸润阳性率随肿瘤恶性程度的增高而增高。3．神经浸润阳性病例中，淋巴转移者占27/35；神经浸润阴性病例中，淋巴转移者占28/57。神经浸润与胆管癌淋巴转移正相关。4．本组病例多数集中在ⅠB至ⅡB期，占本组病例总数的88％（81/92）。随着TNM分期的升高，神经浸润阳性率逐渐增加，至ⅡB期，神经浸润阳性者达88.9％（16/18）。神经浸润与胆管癌TNM分期显著相关。结论1．神经浸润与胆管癌的病理低分化、淋巴转移以及TNM分期密切相关，是胆管癌的重要病理特征之一，可能有助于判断胆管癌的预后。2．神经浸润是胆管癌发生中的早期事件，提示胆管癌是一种高恶性、高浸润性生长的肿瘤。3．疼痛产生的原因是多方面的，神经浸润可能是其中重要原因之一，单纯靠疼痛这一单一因素，不能判断有否神经浸润。论文2：神经生长因子与人胆管癌神经浸润的相关性研究目的探讨神经生长因子及其酪氨酸激酶受体A与人胆管癌神经浸润、淋巴转移、病理类型以及肿瘤分期的关系。方法采用免疫组织化学技术，检测92例人胆管癌组织中β-NGF和Trk A的表达情况，Spearman’s等级相关检验β-NGF的表达与胆管癌神经浸润、淋巴道转移、病理分型以及肿瘤分期的关系。结果1．92例胆管癌中，NGF阳性者65例，阴性27例。NGF和TrkA皆阳性50例，皆阴性22例，二者存在显著的相关性（r=0.542，P＜0.01）。TrkA除了表达于胆管癌细胞，还表达于神经鞘膜。2．神经浸润阳性35例，其中NGF表达阳性率为91.4％；神经浸润阴性57例，其中NGF表达阳性率42.1％。NGF的阳性表达与胆管癌神经浸润正相关。3．NGF表达阳性病例中，淋巴转移者占45/65；NGF表达阴性病例中，淋巴转移者占10/27。NGF阳性表达与胆管癌淋巴转移正相关。4．高、中分化胆管癌中，NGF阳性表达占37/60；低分化组中，NGF阳性表达占28/32。NFG的阳性表达率随着肿瘤恶性程度的增高而增高。5．本组病例多数集中在ⅠB至ⅡB期，占本组病例总数的88％（81/92）。随着TNM分期的升高，NGF的阳性表达率逐渐增加，至ⅡB期，表达率达100％（18/18）。NGF的阳性表达与TNM分期显著相关。结论1．NGF与胆管癌神经浸润密切相关，也与肿瘤的TNM分期密切相关。检测胆管癌组织NGF的表达情况，可能有助于判断预后。2．NGF可能通过旁分泌途径与TrkA作用促使癌细胞延神经转移；通过自分泌途径促进胆管癌细胞增殖。第二部分：稳定表达神经生长因子的胆管癌细胞的建立与培养论文3．神经生长因子真核表达载体的构建及鉴定目的构建人β-NGF真核表达载体并鉴定，为转染胆管癌细胞奠定实验基础。方法1．自正常人脑组织中提取总RNA。根据β-NGF基因序列和pcDNA3.0基因结构设计引物，并加入HindⅢ和XbaⅠ酶切位点。2．采用RT-PCR技术获取β-NGF的cDNA目的片段。回收、纯化后，经双酶切、连接与空载体pcDNA3.0重组构建β-NGF的真核表达载体pcDNA3.0-NGF。3．制备感受态细胞E．coli DH5α，将重组质粒转化感受态细胞。经筛选、抽提后，采用PCR及双酶切鉴定。结果1．RT-PCR后获得β-NGF cDNA，大小约为749bp。2．重组质粒pcDNA3.0-NGF的PCR鉴定结果显示，重组质粒中含有β-NGF基因序列，而空质粒中无目的条带。3．重组质粒pcDNA3.0-NGF的限制性双酶切图谱分析显示，目的基因成功插入载体质粒。结论成功构建β-NGF真核表达载体pcDNA3.0-NGF，可用于后续试验。为研究NGF在胆管癌细胞中的作用奠定试验基础。论文4．pcDNA3.0-NGF转染人胆管癌细胞及其鉴定目的进一步检测pcDNA3.0-NGF质粒的构建结果；建立能稳定表达NGF蛋白的人胆管癌QBC₉₃₉细胞。方法采用Roche公司DOSPER Liposomal Transfection转染系统，将构建好的pcDNA3.0-NGF质粒以15μg/ml的浓度转染至胆管癌QBC₉₃₉细胞。经800μg/ml G418筛选，获得阳性克隆。分别采用RT-PCR技术、免疫细胞化学技术和Western blot技术进行鉴定。结果1．经RT-PCR鉴定，转染pcDNA3.0-NGF质粒后，胆管癌细胞QBC₉₃₉中β-NGF mRNA表达显著增强，高于未转染组和转染空质粒组，OD值半定量分析显示，转染组与对照组相比，差异有统计学意义（t=16.525，P＜0.001）。2．免疫细胞化学检测结果显示，β-NGF阳性表达表现为细胞浆出现黄褐色颗粒。转染pcDNA3.0-NGF质粒前，胆管癌细胞中β-NGF弱表达；转染后，细胞中β-NGF的表达显著增强。3．Western blot检测转染前后细胞内β-NGF的表达情况显示，转染后β-NGF表达增强，而转染后内参β-Actin的表达情况无明显变化，说明pcDNA3.0-NGF质粒能上调β-NGF的表达。结论1．转染pcDNA3.0-NGF后确能增强β-NGF在胆管癌细胞QBC₉₃₉中的表达，进一步证实此前的质粒构建工作是成功的。2．成功建立能够高表达NGF的胆管癌细胞，为研究NGF在胆管癌细胞中的作用奠定试验基础。第三部分：神经生长因子对人胆管癌细胞体外增殖活性和侵袭力的影响论文5：神经生长因子对人胆管癌细胞体外增殖活性和侵袭力的影响目的探讨胆管癌细胞源性神经生长因子对人胆管癌细胞系QBC₉₃₉体外增殖活性和侵袭力的影响。方法采用Roche公司DOSPER Liposomal Transfection转染系统，将构建好的pcDNA3.0-NGF质粒转染胆管癌QBC₉₃₉细胞，转染浓度分别为16μg/ml、32μg/ml、64μg/ml和128μg/ml。转染后，采用RT-PCR技术、Western blot检测胆管癌细胞β-NGF的表达情况。MTT法检测转染前后细胞的体外增殖活性。用Matrigel胶涂布Transwell小室滤膜，检测胆管癌细胞体外侵袭力的变化情况。实验以转染前细胞和转染空质粒细胞作为对照。结果1．转染后胆管癌细胞β-NGF在mRNA水平和蛋白水平上的表达均显著增强，明显高于空白对照组和转染空质粒组，差异有统计学意义（P＜0.01），且mRNA和蛋白的表达水平随转染质粒浓度的增高而增高。2．MTT和Transwell检测结果显示，胆管癌细胞的体外增殖活性和侵袭力随转染浓度的升高而逐渐升高，与对照组比较差异具有显著意义（P＜0.01）。胆管癌细胞的体外增殖活性和侵袭力与β-NGF的蛋白表达呈量效依赖关系。结论胆管癌细胞源性的β-NGF具有促进胆管癌细胞系QBC₉₃₉体外增殖活性和侵袭力的作用。第四部分：神经生长因子对人胆管癌细胞裸鼠体内成瘤及转移能力影响的研究论文6：神经生长因子对人胆管癌细胞体内成瘤及转移能力的影响目的探讨胆管癌细胞源性神经生长因子对人胆管癌细胞系QBC₉₃₉体内成瘤及转移能力的影响。方法将不同质粒转染浓度（16μg/ml、32μg/ml、64μg/ml和128μg/ml）的细胞接种于裸鼠臀部皮下，建立裸鼠人胆管癌动物模型；每周观察肿瘤生长情况和裸鼠存活情况，记录肿瘤大小；析神经生长因子对胆管癌细胞成瘤能力、肿瘤生长速度的影响。8周处死实验动物并解剖，观察肿瘤的重要脏器转移情况。实验以转染前细胞和转染空质粒细胞作为对照。结果1．转染空质粒组与空白对照组比较，胆管癌细胞的成瘤速度没有显著差异。2．转染组与空白对照组比较，胆管癌细胞的成瘤能力显著增强，且随转染质粒浓度的增加以及细胞表达神经生长因子强度的增加而增强。至细胞接种裸鼠臀部后第3周开始，转染质粒浓度64μg/ml组（P＜0.05）和128μg/ml组（P＜0.01）的肿瘤大小与空白对照组的差异开始具有显著意义；至第4周，32μg/ml、64μg/ml、128μg/ml三组的肿瘤大小与空白组对照相比具有显著差异（P＜0.01）。3．至第8周处死实验动物，开腹解剖。128μg/ml组有两只裸鼠出现胆管癌肝脏转移，其余组肉眼下未见转移肿瘤。结论1．胆管癌细胞源性神经生长因子具有增强胆管癌细胞成瘤能力的作用。2．高表达神经生长因子的胆管癌细胞成瘤速度快，易发生远处转移，与肿瘤预后密切相关。小结本研究首先通过对临床病例和病理标本的检测分析，探讨NGF与胆管癌临床病理特征之间的关系，进而通过体内、体外实验研究NGF在胆管癌发展中的作用。通过以上研究结果的分析，得出以下结论：1．38％（35/92）的肝外胆管癌可出现神经浸润，且神经浸润与肿瘤的淋巴转移、低分化水平以及TNM分期紧密相关，是影响肿瘤预后的重要因素。2．神经生长因子高表达于胆管癌组织，其表达强度与胆管癌的神经浸润、低分化水平、淋巴转移以及TNM分期密切相关，提示NGF可能是参与胆管癌神经浸润和恶性进展的重要细胞因子。由于NGF的高亲和力受体TrkA亦表达于胆管癌细胞膜，从而提示，胆管癌细胞可能通过自分泌途径促进自身的增殖与侵袭。3．转染β-NGF基因后的胆管癌细胞，其增殖活性和侵袭力显著增强，且与胆管癌细胞β-NGF的表达量正相关，呈量-效依赖关系。4．肿瘤细胞源性β-NGF能够显著缩短胆管癌细胞在裸鼠体内的成瘤时间，提高其成瘤速度，增强胆管癌的生长及远处转移能力。5．由于目前尚无判断胆管癌预后的有效临床检测指标，NGF的检测可能有助于判断胆管癌的预后。本研究所做工作具有如下创新性：1．通过对92例胆管癌病人的临床资料和病理学分析，明确阐述了神经生长因子与人肝外胆管癌病理特征之间的关系：神经生长因子与胆管癌的神经浸润、细胞低分化、淋巴转移以及TNM分期密切相关。2．神经浸润是胆管癌发展中的早期事件，高度浸润性生长和早期转移是胆管癌重要的生物学特征。3．证实神经生长因子能够促进人胆管癌细胞的增殖活性、侵袭力和成瘤能力，进而促进胆管癌的浸润和转移。4．由于NGF可能是调控多种肿瘤侵袭与转移的上游因子，本研究为胆管癌神经浸润的治疗研究提供了可供备选的分子靶点。