研究背景:据世界卫生组织统计,心血管疾病现已成为全球的头号死因:全球每年死于心血管疾病的人数约占总死亡人数的31%。近来年,由于心肌梗死急性期的死亡率降低以及人口老龄化的原因,心力衰竭的全球发病率呈显著上升趋势。各种原因引起的心力衰竭因其显著降低患者生存质量、导致其反复入院治疗,以及5年死亡率超过50%,故应当引起足够重视,而其关键的病理生理学基础是心肌细胞的不可再生性,而现有的治疗措施均无法逆转心肌细胞的损耗带来的影响,因此,亟待新的安全而有效的治疗策略。促进心肌细胞增殖是唯一可以从本质上补充心肌细胞损耗的治疗策略,目前主要的方法包括外源性干细胞移植和内源性促进心肌细胞增殖和内源性促进成纤维细胞转化。然而过去十年中尝试了各种外源性干细胞移植到受损的心肌中,如间充质干细胞、造血干细胞、内皮祖细胞、心肌祖细胞等,但均未能达到期望效果,尤其是在改善心肌相关功能的方面,并且具有潜在的成瘤性。心肌细胞是心肌组织中承担功能的主体细胞,研究表明,具有增殖分裂能力的心肌细胞主要为单核的心肌细胞,而双核或者多核的心肌细胞继续分裂增殖的比例很小。而在人类的心肌细胞中,单核心肌细胞约占70%,因而具有极大的增殖潜力。因此,探寻内源性促进心肌细胞增殖的机制具有很好的前景。近来研究发现了诸多相关分子以及信号通路在促进心肌细胞增殖方面的作用,但对引起哺乳动物出生后心肌细胞很快退出细胞周期的原因还尚不明确,尤其是引起这一改变的关键上游影响因素。内环境的低氧分压状态是具有心肌组织再生潜能的物种的共有特征之一,如斑马鱼和蝾螈等,而哺乳动物在出生前的子宫内生长阶段同样处于内环境相对低氧分压状态,胎儿脐动脉血氧饱和度只有80%至90%,氧分压约为32至35 mm Hg,而左室内血氧饱和度约为65%,氧分压约为25至28 mm Hg。出生后随着体肺循环的分别建立,内环境迅速脱离低氧分压状态,动脉血氧分压从30 mm Hg升高至100 mmHg,而几乎与此同时心肌细胞也逐渐退出细胞周期,失去增殖与再生的能力。因此,缺氧这一上游因素对于心肌细胞增殖的影响值得深入研究。在心肌缺血梗死后的组织修复过程中,死亡细胞以及梗死区组织碎片的清除主要依赖于损伤激活的局部免疫反应,而巨噬细胞在这一过程中发挥着主要作用。巨噬细胞具有极强的功能多样性,是造血系统中最具可塑性的细胞。在器官发育、稳态,以及组织修复中发挥重要作用。巨噬细胞按其功能可分为促进炎症的M1型巨噬细胞和抑制炎症的M2型巨噬细胞;按其来源可分为胚胎来源驻留巨噬细胞和骨髓单核细胞分化的巨噬细胞。近期有研究发现耗竭巨噬细胞后,新生小鼠在心尖切除后无法通过心肌细胞增殖的途径修复损伤部位,说明巨噬细胞在心肌细胞增殖再生过程发挥重要作用;进一步研究发现心肌组织中不同的巨噬细胞亚型发挥截然不同的作用,在新生小鼠心肌损伤后心肌胚胎来源驻留巨噬细胞明显增多,而在成年小鼠心肌损伤后明显增多的则为骨髓单核细胞来源的巨噬细胞。而且另有研究指出出生后伴随着年龄的增长,心肌胚胎来源驻留巨噬细胞比例以及增殖活性逐渐下降、凋亡比例随之升高,而骨髓来源的巨噬细胞则逐渐成为心肌中主要的巨噬细胞亚型。因此,巨噬细胞,尤其是心肌组织中胚胎来源驻留巨噬细胞对心肌细胞增殖的影响仍然值得继续研究。研究目的和内容:本课题希望通过探寻促进心肌细胞增殖再生的因素和机制,为临床治疗心肌细胞损伤为特征的心脏疾病提供新的治疗思路和治疗策略。实验通过检测紫绀型先心病与非紫绀型先心病心肌组织的心肌细胞增殖现象,探究出生后内环境缺氧对人心肌细胞增殖的影响。通过建立常压缺氧小鼠模型进一步验证缺氧是否具有促进心肌细胞增殖的作用,并检测缺氧对心肌巨噬细胞以及巨噬细胞亚型有无改变。通过缺氧刺激离体乳鼠原代心肌细胞观察单独对心肌细胞缺氧对心肌细胞增殖的影响。实验采用CCR2抑制剂增加心肌组织中胚胎来源驻留巨噬细胞比例,探究巨噬细胞亚型改变对心肌细胞增殖的影响。研究方法:1、在人类心肌组织中检测缺氧对心肌细胞增殖的影响:收集紫绀型先心病患者与非紫绀型先心病患者心肌组织,心肌组织主要取自于梗阻的右室流出道处。紫绀型先心病组主要由法洛四联症患者与右室双出口患者组成,非紫绀型先心病组主要由右室流出道梗阻患者以及右室流出道梗阻合并室间隔缺损患者组成。按年龄层次分组为小于5岁、5至16岁,以及大于16岁。心肌组织标本行免疫荧光检测pH3以及Aurora B在心肌细胞的共表达以评估心肌细胞增殖水平;通过WGA染色检测心肌细胞肥大水平;通过标记c-Kit检测是否存在心肌干细胞或心肌祖细胞从而影响心肌细胞增殖水平。2、用C57BL/6新生小鼠进一步验证缺氧对心肌细胞增殖的作用:实验以C57BL/6小鼠为研究对象,建立常压缺氧动物模型。随机将新生小鼠分为常氧组和缺氧组:常氧组为标准大气压下氮气浓度79%、氧气浓度21%和23℃环境下饲养,缺氧组为标准大气压下氮气浓度85%、氧气浓度15%和23℃环境下饲养。新生小鼠分别于出生后第3天、第6天、第10天取心脏,通过检测心肌细胞pH3、Aurora B共表达反映心肌细胞增殖水平。按上述方法对成年小鼠进行4周缺氧处理后取心脏,检测缺氧对成年大鼠心肌细胞增殖水平的影响。3、检测缺氧处理后小鼠在体心肌巨噬细胞亚型构成比例的变化:取出生后第3天、第6天、第10天缺氧组和常氧组小鼠心肌组织,消化为单细胞悬液,用抗CD45、Ly-6G、F4/80、MHC-II以及CCR2荧光直标抗体标记细胞,通过流式细胞仪检测巨噬细胞水平以及巨噬细胞亚型在缺氧条件下的改变。4、缺氧刺激乳鼠原代心肌细胞观察单独对心肌细胞缺氧对心肌细胞增殖的影响:分离大鼠原代心肌细胞体外培养,随机分为缺氧组与对照组,为模拟生理条件下内环境氧分压状态,缺氧组为氧气浓度1% (氧分压1kPa)处理,常氧组为氧气浓度5%(氧分压5kPa)处理,二氧化碳浓度均为5%,37℃培养24小时、48小时和72小时,通过免疫荧光染色观察pH3在心肌细胞核的表达检测体外心肌细胞增殖水平。5、改变巨噬细胞亚型比例观察巨噬细胞对心肌细胞增殖的作用:将C57BL/6新生小鼠随机分为CCR2抑制剂组和对照组,实验组新生小鼠从出生后第1天开始于背部皮下注射CCR2抑制剂,每天一次,用量为4mg/kg;对照组注射等量不含CCR2抑制剂的溶剂。实验动物在标准大气压下、79%氮气、21%氧气以及23℃环境中饲养,分别于出生后第3天、第6天、第10天取心脏行流式细胞分析,观察巨噬细胞改变情况;免疫荧光检测pH3和Aurora B阳性心肌细胞所占整体心肌细胞比例情况以评估心肌细胞增殖水平。6、统计分析采用GraphPad Prism 6.0软件进行统计学处理,数据采用mean±SEM表示,采用非配对t检验进行显著性检验,p<0.05认为两组具有统计学差异。实验结果:1、慢性缺氧时人心肌细胞增殖能力的实验研究。(1)人类心肌组织冰冻切片免疫荧光结果显示,在紫绀型先心病组婴幼儿心肌标本和非紫绀型先心病组婴幼儿心肌标本中,pH3和AuroraB表达阳性的心肌细胞比例存在显著差异:紫绀型先心病组心肌标本中pH3阳性心肌细胞比例约为非紫绀型先心病组的10倍(p<0.001),并且前者AuroraB阳性心肌细胞比例约为后者的7倍(p<0.05)。而5至16岁组和大于16岁组中紫绀型先心病和非紫绀型先心病心肌组织中心肌细胞增殖水平无统计学差异。表明缺氧可以维持人类出生后的心肌细胞增殖能力。(2) WGA染色显示紫绀型先心病心肌标本与非紫绀型先心病心肌标本在小于5岁组心肌肥大水平无统计学差异(p>0.05),在5至16岁组和大于16岁组中紫绀型先心病心肌标本较非紫绀型先心病心肌细胞面积明显增大(p<0.05)。这一差异可能由长期较高的心脏负荷造成,而婴幼儿心脏负荷较成人偏低,而且持续时间短,与对照组相比尚未出现具有统计学差异的表型。而这一点也反映出婴幼儿心肌细胞增殖现象并非由心肌肥大引起。(3)免疫荧光检测c-Kit阳性心肌细胞显示,在紫绀型先心病和非紫绀型先心病心肌组织标本中均未发现c-kit阳性心肌细胞。表明心肌细胞增殖水平差异与心肌干细胞或心肌祖细胞无关。2、慢性缺氧对小鼠在体和离体心肌细胞增殖能力调节的研究。(1)新生小鼠缺氧处理后较常氧组比较可观察到明显的心肌细胞增殖现象,缺氧组新生小鼠心肌中pH3阳性心肌细胞比例约为常氧组的2.5倍(p<0.001) , Aurora B阳性心肌细胞比例约为常氧组的2.2倍(p<0.05),验证了缺氧对于维持出生后心肌细胞增殖能力的作用。而对于成年小鼠,缺氧组较常氧组并不能增加心肌细胞增殖水平(p>0.05),表明缺氧可以延长出生后心肌细胞增殖的时间窗、延迟心肌细胞退出细胞周期的时间。(2)体外培养培养原代心肌细胞发现缺氧组与常氧组心肌细胞增殖水平没有统计学差异(p>0.05)。表明单纯对心肌细胞缺氧并不能促进心肌细胞增殖,缺氧维持心肌细胞增殖能力依赖于缺氧对心肌细胞所处内环境的改变。3、慢性缺氧对心肌驻留巨噬细胞增殖及不同巨噬细胞亚型构成改变的调节流式细胞术分析显示两组的巨噬细胞总体变化没有明显差异,但缺氧组新生小鼠心肌组织中胚胎来源驻留巨噬细胞比例较常氧组明显增加(p<0.01),并且出生后心肌胚胎来源驻留巨噬细胞比例呈缓慢下降趋势,在出生后6天内缺氧组心肌胚胎来源驻留巨噬细胞比例较常氧组存在显著统计学差异(p<0.01),但这种差异随出生后时间逐渐缩小,在第10天以后差异失去统计学意义。表明缺氧可以改变出生后心肌巨噬细胞亚型的构成,增加心肌驻留巨噬细胞比例。4、心肌驻留巨噬细胞调节心肌细胞增殖能力机制的初步研究(1)流式细胞术检测CCR2抑制剂组和对照组心肌巨噬细胞后显示,在使用CCR2抑制剂期间心肌中胚胎来源驻留巨噬细胞比例明显增加(p<0.01)。表明CCR2抑制剂可以有效改变心肌巨噬细胞亚型构成,增加心肌胚胎来源驻留巨噬细胞比例。(2)心肌组织冰冻切片免疫荧光结果显示,CCR2抑制剂组pH3阳性心肌细胞比例较对照组显著增加(p<0.001),约为对照组的3.5倍;Aurora B阳性心肌细胞比例约为对照组的2.6倍(p<0.05)。表明增加心肌胚胎来源驻留巨噬细胞可以有效维持出生后心肌细胞增殖能力。结论:1、慢性缺氧可以维持人类出生后心肌细胞增殖能力,延长心肌细胞增殖窗口期。2、慢性缺氧维持出生后心肌细胞增殖能力的作用依赖于心肌细胞所处内环境的改变。3、慢性缺氧可以影响出生后心肌组织中巨噬细胞亚型的构成,增加心肌组织中胚胎来源驻留巨噬细胞的比例。4、心肌组织中胚胎来源驻留巨噬细胞参与维持出生后心肌细胞增殖能力。