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第一章外周血内皮祖细胞的分离培养和鉴定目的:研究从正常健康人外周血中提取单个核细胞,用生长因子VEGF165和bFGF诱导分化为内皮祖细胞,进行细胞的鉴定并分析细胞形态、数量、成集落数量和活性。方法:选择正常健康人20例,用密度梯度离心法从外周血获取单个核细胞,将其接种在人纤维连接蛋白包被的培养板,用加入生长因子VEGF165和bFGF及小牛血清的RPMI-1640培养液培养细胞,7d后对贴壁细胞进行细胞分析。荧光显微镜鉴定FITC-UEA-I和DiI-acLDL,双染色阳性细胞为正在分化的EPC;用流式细胞仪检测细胞表面抗原CD34+和KDR;用RT-PCR法检测细胞表面的KDR、CD31、VE-Cadherin和vWF的mRNA表达,采用MTT比色法检测细胞的生长状态;并分析细胞形态和成集落的数量。结果:1.从外周血中利用密度离心法分离出来的单个核细胞在生长因子VEGF165和bFGF的诱导分化下,能分化为内皮祖细胞;2.利用流式细胞仪、荧光显微镜及RT-PCR法鉴定细胞表面的标志,为我们所需要的目的细胞;3.用生长因子VEGF165和bFGF的诱导分化的内皮祖细胞有较好的增殖活性。结论:成人外周血中提取的单个核细胞,在一定条件下可以培养成为内皮祖细胞。第二章冠心病患者外周血内皮祖细胞变化的研究第一节冠心病患者外周血内皮祖细胞数量和活性的研究目的:观察冠心病患者外周血中提取的内皮祖细胞的细胞形态、数量、成集落数量和活性与正常对照组的区别。并研究冠心病患者冠脉狭窄的不同范围和程度及其危险因素与EPC的数量变化的相关性。方法:选择冠心病患者57例和对照组30例,用密度梯度离心法从外周血获取单个核细胞,将其接种在人纤维连接蛋白包被的培养板,用加入生长因子VEGF165和bFGF及小牛血清的RPMI-1640培养液培养细胞,7d后贴壁细胞进行细胞分析和计数。用荧光显微镜鉴定FITC-UEA-I和DiI-acLDL,双染色阳性细胞为正在分化的EPC,用流式细胞仪检测细胞表面抗原CD34+和KDR,用MTT比色法检测细胞的生长状态;并分析两组间细胞形态、细胞数量和成集落的数量的区别。并将冠脉狭窄的不同范围和程度及冠心病患者的危险因素与EPC的数量进行相关分析。结果:1.冠心病患者外周血内皮祖细胞数量较对照组明显减少,而且形成细胞集落数、细胞的增殖能力也明显降低;2.随着冠脉狭窄范围的扩大和狭窄程度的加重,EPC的数量和活性明显下降;3.将冠心病的危险因素与EPC的数量进行相关分析发现,年龄、吸烟、高血压及LDL升高与EPC的数量明显相关。结论:冠心病患者外周血内皮祖细胞的数量、成集落的数量和增殖活性明显降低;冠心病患者外周血内皮祖细胞的数量与冠脉病变的范围和狭窄程度呈负相关;冠心病患者外周血内皮祖细胞的数量与年龄、吸烟、高血压和高脂血症明显相关。第二节冠心病患者外周血内皮祖细胞与纤溶和炎症因子变化的研究目的:根据冠心病患者外周血中内皮祖细胞数量和活性的变化,研究引起冠心病患者内皮祖细胞功能变化机制。方法:将已经分离培养7天的正常对照组和冠心病患者的内皮祖细胞,利用ELISA法和底物发光法检测冠心病患者纤溶因子tPA和PAI的浓度和活性;用RT-PCR法检测tPA和PAI、炎症因子VCAM-1、ICAM-1和PPARγmRNA的表达;用免疫组化法检测VCAM-1和ICAM-1在细胞膜的表达。结果:1.冠心病患者外周血清中tPA的浓度和活性明显下降,而EPC的tPAmRNA的表达中,也出现了同样下降的趋势。2.PAI在外周血清中的浓度和活性及EPC的PAI mRNA的表达均明显升高;3.冠心病患者EPC上的PPARγmRNA的表达较正常对照组明显减弱;4.在冠心病患者外周血中,EPC的细胞胞膜出现了明显的炎症因子VCAM-1和ICAM-1显著浓染,而在RT-PCR中也检测到了VCAM-1和ICAM-1mRNA的表达明显增强。结论:冠心病患者外周血内皮祖细胞的纤溶功能明显受到抑制,表现为外周血清tPA的浓度、活性和EPC的tPA mRNA表达的下降和PAI的升高,而炎症因子VCAM-1和ICAM-1的表达明显增强,同时还伴有EPC的的PPARγmRNA低表达。第三章LPS和罗格列酮对EPC纤溶和炎症因子影响的研究目的:观察LPS和罗格列酮干预后EPC的细胞增殖能力、纤溶和炎症因子的改变及其机制。方法:将已经分离培养7天的冠心病患者的内皮祖细胞,分别给与PPARγ激活剂罗格列酮和LPS干预,检测LPS和罗格列酮对细胞增殖能力的影响;利用ELISA法和底物发光法检测纤溶因子tPA和PAI的浓度和活性;用RT-PCR法检测tPA和PAI、炎症因子VCAM-1和ICAM-1及PPARγmRNA的表达;并将各项指标的改变与正常对照组进行比较。结果:1.罗格列酮能明显增强EPC的PPARγmRNA的表达,并呈现浓度和时间的依赖性;2.罗格列酮增强纤溶系统的活性和抑制炎症因子的表达,表现为增强tPA的表达,抑制PAI的活性,炎症因子分泌减少;3.LPS对EPC的细胞增殖能力没有明显的影响,但是它能抑制纤溶系统的活性和表达,促使炎症因子的表达增强;在LPS干预细胞前先用罗格列酮预处理,能明显降低LPS的作用。结论:用LPS能明显抑制EPC的纤溶活性,促使炎症因子的表达,罗格列酮能抑制LPS的作用,并能促使EPC的PPARγmRNA表达增强,增加EPC的增殖能力。