木糖还原酶是酵母木糖代谢的关键酶之一。还原木糖为木糖醇,是酵母代谢木糖的第一步,不同的辅酶偏好性影响木糖代谢工程菌的代谢流向,使其偏向于木糖醇积累或乙醇产生。酿酒酵母自身不具有木糖还原酶,不能利用木糖,但能利用木酮糖。因此,可在酿酒酵母体内克隆并表达天然利用木糖酵母菌的木糖还原酶基因。本文采用分子克隆技术,构建了用于木糖还原酶表达的整合型质粒pYX-AK-xyl1,将其转化酿酒酵母W5后,进行了酶活分析。质粒构建过程中,首先,以休哈塔假丝酵母基因组DNA和质粒PKT0150为模板,克隆得到了木糖还原酶基因xyl1,KanR及ADHt终止子序列,长度分别为1.1kb,1.5kb,370bp。以酿酒酵母整合质粒p406ADH1为基本骨架,通过基因重组技术引入ADHt终止子,替换掉cyc1终止子,形成完整的ADH启动子-终止子序列,构建了质粒pYX-ADH;在此基础上,又引入G418抗性基因,构建了质粒pYX-AK;及由URA3介导的、用于转化酿酒酵母W5表达的质粒pYX-AK-xyl1。转化后,筛选得到4个重组子YX-1、YX-2、YX-3及YX-4,以不同辅酶诱导,4个转化子酶活(NADH、NADPH)分别为6.070 U/mg和6.128U/mg、5.419 U/mg和5.814 U/mg、6.513 U/mg和7.080 U/mg、4.707 U/mg和6.285 U/mg。重组菌在无选择压力培养条件下酶活测定表明,重组子仍利用2种辅酶,其中,菌株YX-3利用NADH和NADPH的酶活最高,为6.513U/mg和7.080U/mg,比受体菌W5提高了1.4倍和1.3倍,但低于出发菌株20335,其酶活比为0.919。这说明休哈塔假丝酵母的木糖还原酶可以利用NADH和NADPH两种辅酶,但主要依赖于NADPH。重组质粒pYX-AK-xyl1的构建,使木糖还原酶基因整合到酿酒酵母W5的染色体基因组上,并在W5中成功的进行了表达。木糖还原酶辅酶偏好性的研究为后续利用木糖的重组酿酒酵母的构建奠定基础,为微生物的木糖代谢工程和植物纤维素的生物转化制取乙醇研究提供基础。