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组织工程皮肤是组织工程研究中最成熟的技术之一,但目前应用于临床的组织工程皮肤的种子细胞均来自异体,难以成为永久性皮肤替代物。因此,本实验以人表皮干细胞(hKSCs)和人真皮成纤维细胞(hDFs)作为种子细胞,利用鼠尾胶原制备真皮支架材料,体外构建组织工程复合皮肤,为永久性皮肤替代物的研究进行有益的探索。应用联合酶消化、快速贴壁筛选和无血清培养法,自成人包皮中快速分离hKSCs;同时应用联合酶消化、差速贴壁法分离hDFs,通过显微镜观察、免疫细胞化学、间接免疫荧光、流式细胞术、RT-PCR及Western blot等方法,从形态学、分子标志物、细胞周期等方面对获得的hKSCs和hDFs的生物学特性进行检测。用醋酸溶解法制备鼠尾胶原凝胶,经真空冻干法制备真皮支架材料,利用显微镜观察、免疫荧光等方法对真皮支架材料的形态结构、稳定性、生物相容性等理化特性进行检测。分别将15代以内的hDFs及分离自同一成人包皮组织的hKSCs和hDFs接种于支架材料上,进行共培养及气液面培养,通过HE染色、免疫组织化学、双重免疫荧光及扫描电镜等对构建的组织工程皮肤进行观察。结果显示:1.获得的hKSCs、hDFs具有较高的纯度、较好的活力和良好的增殖能力,能够进行稳定的传代培养及冻存、复苏,为组织工程提供充足的种子细胞来源;2.制备的真皮支架材料具有多层孔隙结构,各孔隙互相交通,并具有良好的孔隙率、稳定性、生物可降解性、细胞相容性及安全性,能够诱导细胞长入及新生血管形成,是构建组织工程皮肤理想的支架材料;3. hDFs均匀分布于真皮支架中,不仅保持稳定的增殖能力,而且可能开始分泌细胞外基质成分,发挥着天然真皮中成纤维细胞的功能。hKSCs粘附于含有活的hDFs的真皮支架材料上,伸展良好,经气液面培养形成复层表皮结构,具备表皮层和真皮层。综上所述,我们建立了高效分离、纯化、培养及扩增hKSCs和hDFs的方法,制备了具有合理的空间结构及良好的稳定性、生物可降解性、细胞相容性和安全性的真皮支架材料,成功构建具有表皮层和真皮层的组织工程复合皮肤,为开展无免疫排斥的个性化治疗及永久性皮肤替代物的研究打下坚实的实验基础。