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本文研究目的:对氨基乙酰丙酸(aminolevulinicacid,ALA)在激活淋巴细胞中的聚集情况、光动力疗法的条件以及选择性清除淋巴细胞进行探索性实验研究,初步探讨该方法清除淋巴细胞的可能机制。
研究方法:
1、取正常人的外周血单个核细胞(PeripheralBloodMononuclearCell,PBMC)进行单向淋巴细胞混合培养(MixedLymphocyteCulture,MLC)5d后,分别加入终浓度为0.5mmol/L、lmmol/L、1.5mmol/L、2mmol/L、2.5mmol/L的ALA,并分别孵育2h、4h、6h。用410nm光源照射MLC细胞,然后加入MLC时使用的刺激细胞继续混合培养。使用MTT比色法测量各孔的吸光度值,并计算MLC细胞对刺激细胞的杀伤率。通过单向MLC细胞对刺激细胞的杀伤率比较ALA-PDT清除单向MLC细胞的效果。
2、制备单向混合淋巴细胞,用AnnexinV-FITC/PI流式细胞仪检测ALA-PDT处理对MLC细胞的杀伤情况。
3、将同种异体外周血单个核细胞按单向混合淋巴细胞培养方法制备MLC细胞。对MLC细胞进行ALA-PDT处理后,将其分别与制备MLC细胞时使用的刺激细胞、第三方正常人PBMC以及K562细胞、HL60细胞按1:1混合培养48h。MTT比色法检测细胞活性,并计算ALA-PDT处理后的MLC细胞对不同细胞的杀伤率。
研究结果:
1、ALA+光照处理后的MLC细胞对刺激细胞的杀伤率明显地低于光照组、ALA组和对照组,分别为33%26.5%比87.1%±2.24%、89.2%±2.52%、90.3%±1.93%,P<0.005;光照组、ALA组和对照组杀伤率均较高,且三组之间无显著差异,P>0.1。其中2.0mmol/L、孵育4h组MLC细胞对刺激细胞的杀伤率最低。
2、ALA-PDT清除同种异体激活淋巴细胞以凋亡为主。
3、ALA-PDT处理后的MLC细胞对刺激细胞的杀伤率明显低于对第三方正常人PBMC、K562细胞和HL60细胞的杀伤率,分别为32.4%±1.16%比78.1%±0.952%、75.5%±2.40%和77.0%±1.13%(P<0.001);而ALA-PDT处理后的MLC细胞对第三方正常人PBMC、K562细胞和HL60细胞的细胞杀伤率三组之间,除对第三方正常人PBMC和HL60细胞之间无显著差异(P>0.05)外,其余两两比较均有明显差异,P<0.05。
研究结论:
1、使用ALA-PDT能够选择性清除同种异体激活的淋巴细胞;
2、不同ALA剂量和不同孵育时间清除激活淋巴细胞结果不同;
3、孵育时间相同时,随着ALA浓度的增加,清除效果增强;
4、在ALA浓度为2.0mmol/L时,孵育4h后清除效果最强;
5、ALA-PDT可能通过诱导细胞凋亡的方式选择性清除同种异体激活的淋巴细胞;
6、ALA-PDT后的淋巴细胞具有对第三方正常人PBMC以及肿瘤细胞的杀伤作用。