论文部分内容阅读
背景急性 CO 中毒后迟发性脑病（delayed encephalopathy after acute carbon monoxide poisoning,DEACMP）是急性 CO 中毒（acute carbon monoxide poisoning,ACMP）患者经过（2～60d）假愈期后出现的一系列神经精神症状。其发病机制复杂,多与组织缺血缺氧、氧化应激损伤、免疫炎症级联反应相关。研究发现Rho/ROCK信号通路在中枢神经系统疾病中可激活p38 MAPK进而调节促炎细胞因子,如IL-6、TNF-α。提示Rho/ROCK信号通路可能与DEACMP免疫失调和炎症激活相关。目的通过建立DEACMP大鼠模型,探索ROCK激酶抑制剂H1152是否改善急性CO中毒所致脑损伤及Rho/ROCK信号通路下游相关炎症因子IL-6和TNF-α在不同时间点DEACMP大鼠脑内的表达水平,为治疗急性CO中毒后迟发性脑病神经损伤提供新的方向。方法1.购入80只SPF雄性SD大鼠,体重为200～220 g,随机分为模型组（CO组,n=70 只）和对照组（Control 组,n=10 只）。在独立通风系统（individual ventilated cages,IVC）适应性饲养1周后建立动物模型,模型组大鼠首次腹腔注射100ml/kg CO气体,此后3次注射容量50ml/kg,每次间隔4h。Control组采用同等方法注射等容量空气。2.将模型组大鼠随机分为两组（CO组,n=30只;CO+H1152组,n=24只）。C O+H1152组连续5天腹腔注射ROCK激酶抑制剂H1152,注射剂量为10mg/kg。Co ntrol组和CO组连续5天腹腔注射等容量0.9%生理盐水。3.于造模后1周（W）、2W、3W进行Y-迷宫、新物体识别、旷场、转轮等行为学实验,用以检测各组大鼠运动能力及认知功能。脱髓鞘染色检测不同时间点各组大鼠脑组织神经病理学改变。Western-blot、免疫荧光检测大鼠脑区（海马、额叶、纹状体）ROCK2、RhoA、P-P38及相关炎症因子TNF-α、IL-6蛋白表达情况。4.所有实验数据使用SPSS 25.0统计学软件进行统计学分析,不同组别比较使用独立样本t检验,不符合正态分布的实验数据采用非参数检验方法。P＜0.05表示两组数据差异具有统计学意义。结果1.DEACMP模型大鼠行为、病理及蛋白分子的改变（1）行为学结果显示:在旷场实验中,与Control组相比,CO组大鼠在CO中毒后的第1周、第2周、第3周三个时间节点行动总距离都减少,且均具有统计学差异（P＜0.05）。同时在转轮疲劳实验中,与Control组比较,CO组大鼠的攀爬能力在第1周呈现下降趋势,在第2周、第3周显著下降,均具有统计学差异（P＜0.05）。新物体识别实验中,CO组大鼠相较于Control组大鼠在第1周、第2周、第3周的辨别指数明显降低,且三个时间点两组大鼠差异均具有统计学意义（P＜0.05）。Y迷宫实验结果与新物体识别结果一致,CO组大鼠进入新异臂的时间均显著低于Control组大鼠（P＜0.05）。（2）病理结果显示:与Control组比较,在CO中毒后的第1周、第2周、第3周胼胝体髓鞘染色结果显示CO组大鼠髓鞘染色不均匀,排列稀疏,胼胝体着色变浅,髓鞘有断裂、脱失现象。通过Control组与CO组行为学结果和病理髓鞘染色发现CO组大鼠与DEACMP临床表现及影像学特征相似,说明DEACMP模型大鼠制备成功。（3）Western-blot结果显示:与Control组相比,CO组大鼠在CO中毒后的第1周海马区RhoA、P-P38,额叶RhoA、ROCK2、P-P38、TNF-α以及纹状体部位RhoA、ROCK2、P-P38、IL-6、TNF-α蛋白表达含量均明显升高（P＜0.05）。第2周CO组大鼠海马区 RhoA、ROCK2、P-P38、IL-6、TNF-α,额叶 RhoA、ROCK2、TNF-α 以及纹状体部位RhoA、ROCK2、P-P38、IL-6、TNF-α蛋白表达含量均明显升高（P＜0.05）。第 3 周 CO 组大鼠海马区 RhoA、ROCK2、P-P38、IL-6、TNF-α,额叶 RhoA、ROCK2、P-P38、IL-6、TNF-α 以及纹状体部位 RhoA、ROCK2、P-P38、TNF-α 蛋白表达含量均明显升高（P＜0.05）。（4）免疫荧光结果显示:与Control组相比,CO组大鼠在CO中毒后的第1周、第2周、第3周海马CA1区IL-6、TNF-α平均荧光强度均显著增强（P＜0.05）。通过Control组与CO组Western-blot结果和免疫荧光结果发现,CO组大鼠RhoA、ROCK2、P-P38、IL-6、TNF-α蛋白表达含量在不同时间节点均增多或显著增多,说明DEACMP模型大鼠与Rho/ROCK信号通路介导的免疫失调和炎症激活相关。2.ROCK抑制剂H1152对DEACMP模型大鼠行为、病理及蛋白分子的影响（1）行为学结果显示:在旷场实验中,与CO组相比,CO+H1152组大鼠在给予抑制剂干预后的第1周、第2周、第3周的运动总距离均增加,且均具有统计学差异（P＜0.05）。同时在转轮疲劳实验中,与CO组相比,CO+H1152组大鼠的攀爬能力在第2周显著增强,具有统计学差异（P＜0.05）。在新物体识别实验中,CO+H1152组大鼠相较于CO组大鼠在第1周、第2周的辨别指数明显升高,差异均具有统计学意义（P＜0.05）。Y迷宫实验中,CO+H1152组大鼠在第1周、第2周、第3周进入新异臂的时间显著高于CO组大鼠,差异均具有统计学意义（P＜0.05）。（2）病理结果显示:与CO组相比,CO+H1152组大鼠在给予抑制剂H1152干预后的第1周、第2周、第3周,髓鞘断裂、脱失现象均有所好转。（3）Western-blot结果显示:在给予抑制剂H1152后的第1周,与CO组相比,CO+H1152组大鼠海马区RhoA、P-P38、TNF-α,额叶TNF-α以及纹状体部位RhoA、P-P38、IL-6、TNF-α蛋白表达含量均明显减少（P＜0.05）;第2周,CO+H1152组大鼠海马区 RhoA、ROCK2、TNF-α,额叶 RhoA、ROCK2、P-P38、IL-6、TNF-α 以及纹状体部位RhoA、ROCK2、P-P38、IL-6、TNF-α蛋白表达含量均显著减少（P＜0.05）;第3周,CO+H1152组大鼠额叶RhoA、TNF-α以及纹状体部位P-P38蛋白表达含量均显著降低（P＜0.05）。（4）免疫荧光结果显示:与CO组相比,CO+H1152组大鼠海马CA1区在给予抑制剂后的第1周IL-6平均荧光强度显著减弱,具有统计学差异（P＜0.05）;第2周、第3周IL-6平均荧光强度呈下降趋势。第1周、第2周、第3周TNF-α平均荧光强度均显著下降（P＜0.05）。结论1.DEACMP的发病机制与Rho/ROCK信号通路异常导致免疫失调和炎症激活相关。2.ROCK抑制剂H1152可通过干预Rho/ROCK通路减轻DEACMP模型大鼠的炎症反应。