【摘 要】
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胶质瘤是神经外胚层衍化而来的胶质细胞和（或）具有胶质细胞分化特性的神经组织来源的肿瘤。作为一种原发颅内的、常见的恶性肿瘤,胶质瘤约占脑部恶性肿瘤的50%左右,具有增殖速度快、侵袭性高、弥漫性扩散等生物学特性。因无法通过手术完全清除,药物无法透过血脑屏障、患者产生耐药性等原因,使胶质瘤的治疗效果差、复发率高,患者五年存活率不足1%。目前,临床上主要根据肿瘤的坏死程度、微血管的增生程度、细胞的异性型程
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胶质瘤是神经外胚层衍化而来的胶质细胞和（或）具有胶质细胞分化特性的神经组织来源的肿瘤。作为一种原发颅内的、常见的恶性肿瘤,胶质瘤约占脑部恶性肿瘤的50%左右,具有增殖速度快、侵袭性高、弥漫性扩散等生物学特性。因无法通过手术完全清除,药物无法透过血脑屏障、患者产生耐药性等原因,使胶质瘤的治疗效果差、复发率高,患者五年存活率不足1%。目前,临床上主要根据肿瘤的坏死程度、微血管的增生程度、细胞的异性型程度以及核的分裂等来评估患者的病理分级,但此种方式具有一定的局限性。因此急需寻找新的标记物对胶质瘤的恶性程度进行病理分级,以提高评估的客观性与准确性。钾离子通道（Potassium channel,K+通道）是一大类存在于细胞膜上的亲水性微孔道,除了维持细胞的静息电位,调控动作电位的主动复极之外,还参与细胞的增殖、分化、迁移和凋亡等多种生理过程。Kv1.5通道是由KCNA5基因所编码的Kv通道亚家族成员,在去极化的膜电位下其电流具有快速激活、外向延迟、缓慢失活等特性,广泛分布于心脏、脑、肾脏、腺体和肌肉等组织,参与可兴奋细胞的复极化及非可兴奋细胞的信号转导。本课题组前期发现,Kv1.5通道蛋白与Caveolin-1蛋白在不同乳腺上皮细胞中的表达具有相关性,阻断K+通道,可抑制乳腺上皮细胞的增殖,同时Caveolin-1可通过AKT信号通路促进Kv1.5通道蛋白的表达。本文对Kv1.5通道在肿瘤组织和细胞中的表达,及与肿瘤细胞的增殖、凋亡等过程中的作用,围绕Kv1.5通道与胶质瘤的发生发展开展研究,研究结果如下:分析Kv1.5通道的生物学特性及与人胶质瘤组织病理分级的关系。利用全细胞模式的膜片钳,记录到一种跨膜、电压依赖、外向整流的K+电流,其电流幅值可被4-AP抑制;利用RT-PCR、Western Blot和免疫荧光等方法分析了 Kv1.5通道蛋白在不同细胞中的表达情况,显示Kv1.5通道在不同细胞中差异表达,并且呈点状分布于细胞膜上;利用HE染色、免疫组化方法明确所获得的临床标本为上皮组织来源的人脑恶性胶质瘤组织,同时发现Kv1.5通道蛋白的表达水平与胶质瘤组织的病理分级呈负相关。探讨Kv1.5通道对胶质瘤细胞存活率的影响及与自噬的关系。利用MTT 比色法分析不同抑制剂（K+通道的广谱抑制剂TEA、Kv通道的抑制剂4-AP、Kv1.5通道特异性抑制剂DPO-1）对细胞存活率的影响,发现作用24 h、48 h、72 h,细胞存活率均呈剂量、时间依赖性的降低;当1 μmol/L的DPO-1抑制Kv1.5通道1 h,U251细胞的存活率先显著升高（P<0.05）,随后下降,与自噬的双向调节作用相似;Western Blot显示增加了自噬相关蛋白LC3-Ⅱ与LC3-Ⅰ表达量的比值,抑制了 mTOR信号蛋白的磷酸化,并且吖啶橙染色显示增加了酸性水解酶的活性,表明特异抑制Kv1.5通道诱发U251细胞发生自噬。提出Kv1.5通道参与胶质瘤细胞自噬的机制。首先构建了 Kv1.5通道蛋白的siRNA和过表达载体,利用基因转染技术分别沉默和过表达Kv1.5通道蛋白的表达水平,Western Blot结果显示下调Kv1.5通道,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值增加,mTOR的磷酸化水平降低,激活ERK信号通路;相反地,上调Kv1.5通道,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值减少,促进mTOR的磷酸化,ERK信号通路的磷酸化水平降低,表明Kv1.5通道蛋白参与胶质瘤细胞的自噬,其机制与ERK信号通路有关。其次流式细胞术和Rh123染色显示,下调Kv1.5通道,细胞发生早期凋亡,加入自噬抑制剂CQ,MMP下降;相反地,上调Kv1.5通道,凋亡细胞数量减少,加入自噬诱导剂Rapa后,MMP升高,表明Kv1.5通道参与胶质瘤细胞的早期凋亡与自噬有关。分析差异表达Kv1.5通道的胶质瘤细胞的差异表达基因。对改变Kv1.5通道蛋白表达水平的细胞进行RNA-Seq分析,发现下调Kv1.5通道,筛选得到411个差异表达基因,通过GO、KEGG、Reactome和互作蛋白分析等方法,发现ERK上调,胞吞通路和分子伴侣介导的自噬通路富集,Cav-3蛋白下调,从基因水平揭示Kv1.5通道与胶质瘤细胞的自噬相关。综上,研究表明Kv1.5通道与胶质瘤病理分级呈负相关:在低分级的胶质瘤组织中表达量多,高分级的胶质瘤组织中Kv1.5表达量少;同时转录组与蛋白的结果均表明调节Kv1.5通道的表达可诱发U251细胞发生自噬,其机制与ERK信号通路有关,并且Kv1.5通道参与胶质瘤细胞的早期凋亡也与自噬相关。本论文为阐明Kv1.5通道在胶质瘤的生物学功能提供新的理论依据,也为临床治疗胶质瘤拓展新的思路。
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