弯曲菌病是一种重要的人畜共患病,与人类的日常生活息息相关。感染弯曲菌病可能会引起腹泻,小肠结肠炎,流产以及胎儿死亡。此外,弯曲菌的感染也与一种神经性疾病——格林巴利综合征有关。弯曲菌通常存在于许多动物的肠道内,如鸡、鸭、鹅等。有研究发现,灵长类动物也可以作为弯曲菌的宿主。猴属于灵长类动物,具有与人类相似的身体结构、遗传结构和生活习惯。在以非人灵长类动物为主的养殖和研究中,弯曲菌的感染可能会导致许多问题,如影响实验进展,影响非人灵长类动物的生长和繁殖,危害公共环境,危害与其接触人员的健康等。因此了解弯曲菌在猴群中的流行,减少弯曲菌的感染和避免不必要的交叉感染,同时采取一些措施来预防弯曲菌的感染显得尤为重要。本实验的研究目的为:(1)调查弯曲菌在猴群中的分布规律和流行特点,并探索弯曲菌在不同养殖环境中的流行规律;(2)通过跟踪采样调查新生猴成长过程中的弯曲菌的感染规律及其分离株的流行特征;(3)进一步探索猴源弯曲菌分离株的分子流行病学特性和耐药特性。一.不同样品中及不同养殖模式下弯曲菌的流行状况从2017年4月至2018年12月,共采集A、B、C三家养殖场共1668份样品,其中包括1275份猴肛拭样(剔除重复采集的样本数)、371份环境样和22份工作人员肛拭样,共分离到弯曲菌405株,其中空肠弯曲菌82株,结肠弯曲菌317株,其它弯曲菌6株。猴的弯曲菌阳性率为29.2%。将1275只猴的弯曲菌感染情况样按被采样猴的年龄进行分析,以每4岁(48个月)为一个年龄段,弯曲菌阳性率随猴年龄的增长呈递减趋势,且差异显著(P<0.05)。按被采样猴的性别进行分析,雌性总弯曲菌感染率(32.6%)高于雄性(18.3%),且差异显著(P<0.05)。按被采样猴的种类进行分析,食蟹猴的弯曲菌感染率(35.6%)显著高于恒河猴(13.6%)。由于只有A养殖场的猴出现腹泻症状,所以对A养殖场的973只猴子单独进行分析,腹泻猴中弯曲菌阳性率(61.7%)高于非腹泻猴(33.4%),且差异显著(P<0.05)。针对弯曲菌污染状况较为严重的A养殖场285份环境样品进行深入分析,共检测出18株结肠弯曲菌,弯曲菌阳性都集中在食槽(10.3%)、地面(6.6%)、工作人员鞋底(30.4%)三类环境样品中。这样的结果说明,猴养殖场弯曲菌的传播可能与对猴粪便的处理方式有关:A养殖场采用粪便从猴笼落地后,工作人员每天用水管冲刷地面的方式,排泄物随水流入下水道,所以地面和工作人员的鞋底均可能携带弯曲菌,导致弯曲菌通过“粪口途径”传播并对猴造成感染。通过深入调查,我们发现了养殖场养殖方法上的不同可能是导致弯曲菌感染的重要原因:A养殖场采用粪便落地后人工用水管冲刷的方式处理猴子的排泄物,B养殖场的饲养员会在笼子下面放置一个装有玉米芯垫料的铁盘使猴子的排泄物落在玉米芯垫料上,并每天更换新垫料。此外,食蟹猴和恒河猴养殖方法不同。工作人员采样大笼群养和小笼独养相结合的方法养殖食蟹猴,且由于实验需要,食蟹猴经常需要在两种笼子中被调换,这样的养殖方式无疑增加了猴与猴之间相互接触的机会,可能也因此造成食蟹猴弯曲菌阳性率较高,而恒河猴全部被单独分开养在小笼子里。综上所述,在猴的养殖过程中,猴的养殖方法和对猴排泄物的处理方式是影响弯曲菌传播的重要因素。二.新生食蟹猴中弯曲菌感染的跟踪调查及分析自2017年8月到2018年6月,跟踪了 10只新生猴的弯曲菌感染情况。新生猴在第1-10周内出现弯曲菌感染仅6次,阳性率最低,为6%。其中出现空肠弯曲菌5次,出现结肠弯曲菌感染1次。第11-20周共出现弯曲菌感染14次,阳性率为14%。其中出现空肠弯曲菌感染6次,出现结肠弯曲菌感染8次。21周及以后共跟踪采集肛拭样品80份,共出现弯曲菌感染28次,阳性率为35%。其中出现空肠弯曲菌10次,结肠弯曲菌18次。在40周龄前的新生猴中,随着新生猴的长大,弯曲菌阳性率越来越高,差异显著(P<0.05)。且空肠弯曲菌的比例不断降低,结肠弯曲菌的比例不断升高。从MLST的结果来看,共测序25株新生猴结肠弯曲菌分离株,测出7种ST型,优势ST 型主要有 ST-3753、ST-828、novel ST5,占 68%(17/25)。7 种 ST 型中新 ST 型有 5种,共包含13株结肠弯曲菌,占所测新生猴结肠弯曲菌总数的52%(13/25)。在新生猴中新ST型发现较多且占比较大,据此猜测是否新生动物的体质更适合菌株的基因发生变化,并产生新的ST型。三.猴源弯曲菌分离株的MLST和耐药性分析对171株结肠弯曲菌进行MLST分型研究,共获得23种不同的ST型,体现了猴源结肠弯曲菌基因组的多样性。其中,主要的优势ST型有:ST-1586、ST-829、ST-3023、ST-1096,占所测分离株总数的45.6%。另外,分离出11种目前PubMLST库中未曾出现的新ST型,新ST型共包含38株分离株,占所测分离株总数的22.2%。其中,17株环境样品结肠弯曲菌分离株共有11种ST型,与猴肛拭样分离株中126株结肠弯曲菌的ST型匹配,占分离株总数的81.8%。此外,黏附侵袭实验表明,菌株的粘附侵袭能力与其ST型不存在显著的对应关系。为了评估抗生素使用对猴场弯曲菌耐药的影响,对35株空肠弯曲菌分离株和79株结肠弯曲菌分离株进行针对12种抗生素的药敏实验。结果表明空肠弯曲菌(82.86%)和结肠弯曲菌(89.87%)的分离株都表现出对环丙沙星的高度耐药。114株弯曲菌分离株中共出现104株多重耐药菌株,共包含43种多重耐药表型。35株空肠弯曲菌中27株菌有多重耐药表型,其中耐2抗菌株占弯曲菌数总数的40%。空肠弯曲菌中多重耐药谱型CIP-LEV(环丙沙星-左氧氟沙星)的菌株数目最多,占空肠弯曲菌总数的18.5%。结肠弯曲菌中多重耐药菌株有77株,其中以耐4抗、5抗和6抗的表型为主,占结肠弯曲菌总数的64.6%,其中耐药谱型为CIP-P-LEV-CRO-CTX-S(环丙沙星-青霉素-左氧氟沙星-头孢曲松-头孢噻肟-链霉素)和CIP-P-E-AZM-LEV(环丙沙星-青霉素-红霉素-阿奇红霉素-左氧氟沙星)的菌株最多,分别占结肠弯曲菌总数的13.0%和10.4%。与空肠弯曲菌相比,结肠弯曲菌的多重耐药现象较为严重。在检测的12种抗生素中,对空肠弯曲菌和结肠弯曲菌敏感性都在80%以上的抗生素包括庆大霉素、阿莫西林,这2种抗生素可考虑用于猴养殖场中弯曲菌感染的防控。