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目的：为了探讨自杀基因在临床肿瘤治疗中的应用，以具有较好靶向性和安全性可以通过重组转化厌氧菌而特异性表达于肿瘤乏氧区的表达型载体PMG36e为构建重组质粒的载体，选择能将原来无毒的前体药物代谢转化成细胞毒性产物的自杀基因-大肠杆菌/胞嘧啶脱氨酶/尿嘧啶磷酸核糖转移酶融合基因(CD::upp)作为目的基因，利用分子生物学相关技术构建PMG36e-CD::upp重组质粒，为转化入双歧杆菌及靶向表达于肿瘤乏氧区并与放疗联合后续实验做准备。
方法：用小量制备质粒DNA的方法分别提取表达型质粒载体PMG-36e和自杀基因pORF-CD::upp,取提取的表达型质粒载体PMG-36e进行1％琼脂糖凝胶电泳，用胶回收试剂盒回收目的条带后用乙酸钾沉淀法纯化浓缩质粒备用；以质粒pORF-CD::upp为摸板扩增CD::upp基因，设计PCR上下游引物时分别加入限制性内切酶Sac Ⅰ和Sal Ⅰ酶切位点,PCR反应条件为： 50μl PCR反应体系中含模板DNA10μl，上下游引物各 5μl,Taq 酶 0.5μl，dNTP(2.0mM) 5μl，10xbuffer 5μl,ddH2O19.5μl。反应参数为：94℃预变性5 min后进入循环:94℃变性60s,选择温度梯度62-66℃退火120s，72℃延伸60s,35个循环后；72℃最终延伸20min，扩增出约为1930bp左右特异性目的片段。各取PCR扩增产物10μl以选择最适退火温度，确定最佳退火温度为62.4℃，进行PCR大量扩增后进行1％琼脂糖凝胶电泳，取分子量为1930bp左右片断进行胶回收及纯化。纯化后的表达型质粒载体PMG-36e与自杀基因CD::upp分别用限制性内切酶Sac Ⅰ与SalⅠ进行双酶切，酶切体系为载体PMG-36e或目的基因CD::upp10μl，限制性内切酶Sac Ⅰ与SalⅠ各1μl，10xbuffer2μl，BSA2μl，ddH2O4μl。酶切体系在37℃进行反应，酶切时间均为4h。终止酶切后取载体PMG-36e 2μl，目的基因coda::upp 3μl，T4DNA ligase 5μl，16℃恒温水浴过夜连接。取连接产物5μl进行1％琼脂糖凝胶电泳初步鉴定。取制备好的感受态菌100μl加入10μl连接产物(DNA<=50ng)42℃水浴2min进行热休克后立即冰浴2min，加入LB培养基800μl，37℃，200mm温和振荡1h后铺板(含红霉素150ug/ml的LB固体培养基)，37℃恒温培养箱培养16h，筛选单克隆传代培养后提取重组质粒鉴定。
结果：PMG-36e-CD::upp重组质粒用化学法转化入大肠杆菌JM109后，提取质粒进行1％琼脂糖凝胶电泳目的条带，与标准Marker相比较分子量约为5.5Kb，与预计大小一致：取重组质粒PMG-36e-CD::upp 10μl，限制性核酸内切酶Sac Ⅰ与SalⅠ各1μl，10xbuffer 2μl，BSA2μl，ddH2O 4μl。酶切体系在37℃进行反应，酶切时间均为4h，最后65℃ 10min灭活酶。取酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳得到1.9kb(coda::upp)和3.6kb(PMG-36e)片断，与预计大小一致；以质粒pORF-CD::upp为模板特异性扩增CD::upp基因，PCR反应条件为：50μlPCR反应体系中含模板DNA10μl，上下游引物各5μl，Taq 酶 0.5μl，dNTP(2.0mM)5μl，10xbuffer 5μl，ddH2O 19.5μl。反应参数为：94℃预变性5 min后进入循环：94℃变性60s，62.4℃退火120s，72℃延伸 60s，35个循环后；72℃最终延伸20min。扩增出约1.9Kb的CD::upp片段。将PMG-36e-CD::upp重组质粒送上海测序部进行测序鉴定，所用测序仪器为ABI PRISM 3730，测序试剂为BigDye terminator v3.1；通过两个测序反应得到两段碱基序列分别为979bp和959bp，分别去除测序引物并且连接后得到1758bp，将此段连接序列用DNAstar软件分析示与GENEBANK上公布的原序列一致，无开放读码框架移位及改变，无基因突变，可用于后续实验的表达研究。
结论：成功构建PMG-36e-CD::upp重组自杀基因，经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，特异性PCR扩增鉴定，限制性核酸内切酶双酶切鉴定及测序证实重组质粒构建成功，经DNAstar分析软件分析示重组质粒与GENEBANK上公布的原序列一致，无开放读码框架移位及改变，无基因突变，可用于后续实验的表达研究。