本实验用MPP<+>诱导PC12细胞建立帕金森细胞模型，已经证实利福平具有降低MPP<+>诱导的PC12细胞凋亡率及抑制细胞内α-synuclein表达量的作用。本课题是在这一研究结果的基础上，继续探讨利福平对MPP<+>诱导的PC12细胞神经毒性作用的抑制作用及其作用的途径。 二、研究目的: 通过MPP<+>诱导PC12细胞建立帕金森细胞模型，不同浓度利福平干预后，观察各处理组细胞凋亡率、凋亡形态学及α-synuclein表达量的变化，证实利福平是否具有抑制MPP<+>所致的神经细胞毒性作用。并进一步观察利福平作用后，各组细胞中caspase-3激活率、线粒体结构变化及ATP表达量的变化，探讨利福平抑制细胞毒性作用的信号转导途径。 三、实验对象: 1．细胞株 PC12：大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤细胞株。 2．细胞培养、凋亡诱导及干预分组 PC12细胞置于DMEM/F12培养基中进行培养，每隔48h换培养液，当单层培养细胞汇合以后，传代培养。将PC12细胞传入培养板中，待细胞进入对数生长期后加药，加入不同剂量的利福平，利福平溶解于甲醇中，使终浓度分别达到0、100、200、300 μ mol/L，2h后分别加入MPP<+>，终浓度为1mmol/L，继续培养48h，即可进行结果检测。以上剂量及处理用于所有实验。 四、研究方法: (1)凋亡的形态学观察 ①Hoechst33342荧光染色：细胞接种于多聚赖氨酸预处理的6孔板上，加药处理48小时后，多聚甲醛固定细胞，加入Hoechst33342室温避光染色15min，置于荧光显微镜下在波长为365nm的紫外激发光下观察、拍照。 ②Tunel原位末端标记法：细胞接种于多聚赖氨酸预处理的6孔板上，加药处理48小时后，戊二醛固定，蛋白激酶K通透、H202淬灭、TdT标记、辣根过氧化物酶反应后，DAB镜下显色，甲基绿复染，过氨水，置于倒置显微镜下观察、拍照。 (2)流式细胞仪检测细胞凋亡率细胞接种于6孔板上，加药处理48小时后，胰酶消化，离心，PBS漂沈，加入Annexin V-FITC和PI染液重悬细胞，室温避光温育10分钟，HEPES洗涤后过滤上机检测各组细胞凋亡率。 (3)Western Blot免疫印记检测α-synuclein的表达各组细胞接种于培养板上，加药处理48小时后，细胞裂解液裂解细胞，提取细胞总蛋白；BCA-100蛋白质定量检测试剂盒测定样品总蛋白含量；每泳道加总蛋白20 μ g进行SOS-PAGE凝胶电泳后电转移至硝酸纤维素膜上，封闭液封闭3h，一抗4℃孵育过夜，与辣根过氧化物酶标记二抗室温下孵育1h，X线胶片曝光1～10min，显影、定影，图像分析处理。 (4)流式细胞术检测caspase-3激活情况各组细胞接种于6孔板上，加药处理同前，培养48小时后，胰酶消化，离心，PBS悬浮，破膜剂破膜通透，一抗孵育15min，再加荧光标记二抗，用流式细胞术的方法计算各组每10<5>细胞中caspase-3激活的比率。 (5)透射电子显微镜超微结果观察细胞接种于6孔板上，加药处理48小时后，电镜液固定15min，3000rpm离心，锇酸固定90min，梯度酒精及丙酮脱水，包埋剂渗透，过夜，60℃聚合，超薄切片，置于铜网上，铀、铅染色，于透射电子显微镜下观察、拍照。 (6)ATP表达量检测各组细胞接种于6孔板上，加药处理同前，培养48小时后，裂解液裂解，离心，收集上清，各组取等量与ATP检测工作液反应，luminometer检测自发荧光的荧光强度，利用标准曲线及蛋白定量测定，计算各组ATP含量的情况。 五、统计学处理: 结果以均数±标准差表示。两组间均数比较采用两独立样本的t检验，多组间比较采用单因素方差分析。数据采用SPSS14.0统计软件包分析，P<0.05表示有统计学差异。 六、实验结果: 1．凋亡形态学观察结构 ①荧光显微镜下见凋亡细胞的Hoechst33342荧光染色明显增强，胞核缩小，核膜皱缩，染色质凝聚、边缘化、碎裂。MPP<+>处理组、甲醇&MPP<+>组凋亡细胞数量较多，且可见明显核碎裂；利福平&MPP<+>各浓度组随着利福平浓度的增高，凋亡细胞的数量逐渐减少，荧光强度减弱，核凝聚、碎裂程度减轻。 ②Tunel倒置显微镜下可见凋亡细胞呈棕褐色，胞浆凝固，胞体变小。MPP<+>处理组、甲醇＆MPP<+>处理组凋亡细胞的数量较多，利福平&MPP<+>各浓度组随着利福平浓度增高，凋亡细胞的数量逐渐减少。 2．流式细胞仪检测凋亡率结果流式细胞凋亡率检测结果，正常对照组、MPP<+>处理组、甲醇&MPP<+>组及利福平(100、200、300 μ mol/L)&MPP<+>各浓度组的细胞凋亡率分别为10．63﹪±0.98﹪、67.35﹪±1.72﹪、74.74﹪±1.85﹪、63.45﹪±1.24﹪、27.01﹪±2.74﹪、22.35﹪±2.9﹪；结果显示MPP<+>组及甲醇&MPP<+>组的细胞凋亡率明显高于正常对照组，而利福平＆MPP<+>各组随着利福平的浓度增加，细胞凋亡率明显下降，利福平＆MPP<+>各浓度组与MPP<+>组比较，P<0.05，差异有统计学意义。 3．Western blot免疫印记检测α-synuclein显示免疫印记结果显示，MPP<+>促进α-synuclein的表达并聚集形成三聚体，随着利福平的药物浓度增大，α-synuclein三聚体蛋白的表达减少，而甲醇&MPP<+>组与MPP<+>组无差异。 4．流式细胞术检测各组caspase-3激活比率 MPP<+>组与等体积甲醇&MPP<+>组细胞caspase-3的激活率最高，分别为(37.5±2.13)﹪、(39.8±3.50)﹪，与正常对照组(3.15±1.33)﹪比较有明显差异(P<0.05)。利福平&MPP<+>各浓度组随着利福平浓度的增高，caspase-3的激活率逐渐降低，分别为(31.4±3.18)﹪、(20.8±4.72)﹪、(11.5±2.93)﹪，各组与MPP<+>组比较均有统计学差异(P<0.05)。 5．利福平作用细胞内超微结构的变化透射电子显微镜下见MPP<+>组、甲醇＆MPP<+>组细胞胞浆内线粒体明显肿胀，空泡化，嵴消失，结构不清；核内染色质浓缩、边集、核变小，部分细胞核碎裂见凋亡小体形成。利福平&MPP<+>各浓度组随利福平浓度的增高，胞浆内线粒体空泡状结构逐渐减轻，内部嵴结构出现，其中300 μ mol/L利福平组细胞内结构清楚，仅见线粒体轻度肿胀；各组胞核内染色质浓缩、边集现象较MPP<+>组明显减轻。 6．利福平对ATP表达量的影响 MPP<+>组、等体积甲醇&MPP<+>组与正常对照组比较ATP值降低，P<0.05，差异明显；利福平各浓度组随着利福平浓度的增高，ATP值逐渐降低，高浓度利福平组与MPP<+>组比较，P<0。05，均有统计学差异，说明利福平具有抑制ATP表达的作用。以不加MPP<+>仅加利福平、甲醇各浓度作为对照，加入利福平各组，随利福平浓度的增加，其ATP值仍然逐渐降低，高浓度利福平组与正常对照组、甲醇对照组比较，P<0.05，均有统计学意义。 七、结论: 1．MPP<+>诱导PC12细胞可以成功表达帕金森特征性病理及生化特征，能够用来做为PD研究的细胞模型。 2．利福平能够降低MPP<+>诱导PC12细胞的凋亡率，减轻细胞凋亡程度；同时，能够抑制细胞内α-synuclein的聚集及表达。 3．利福平作用后，可以明显降低caspase-3的激活率，它对PC12细胞神经毒性作用的抑制是通过阻断下游caspase-3凋亡信号途径实现的。 4．利福平可以减轻MPP<+>所致PC12细胞的线粒体结构的变化，减轻线粒体肿胀及嵴损伤程度；但是随利福平浓度的增高，细胞内ATP表达值逐渐降低。 5．利福平具有抑制MPP<+>所致PC12细胞神经毒性作用，这一作用究竟是通过阻断哪个环节实现的，尚不清楚，需要进一步更深入的研究。