研究背景黄韧带增生肥厚、骨小关节增生等腰椎后部结构退变,引起腰椎管狭窄症(Lumbar Spinal Stenosis,LSS)导致脊髓、神经根受压,是造成老年人运动功能障碍的常见原因之一。当今治疗LSS的有效的方式多采用手术治疗,不仅病人要经历病痛的折磨和漫长的恢复期,而且手术花费巨大造成沉重的经济负担。尽管有如此大的危害,但引起LSS主要病因的黄韧带增生肥厚的病理机制还不明确,如果能从发病的早期入手进行本病的诊断和预防,阻断黄韧带向增生肥厚阶段的转化,进而降低腰椎管狭窄症发病机率,将使临床医生获取除手术方法以外的治疗选择。组织学研究发现,正常黄韧带中弹性纤维构成占75%,其余为胶原。胶原主要由Ⅰ型和Ⅲ型胶原分子组成,增生肥厚黄韧带是以弹性纤维减少、胶原纤维的大量增生导致的纤维化为特征,而Ⅱ型胶原的增生、骨化和钙晶体的沉着表现为黄韧带的钙化、骨化。黄韧带增生肥厚和黄韧带钙化是同一人体组织不同的病理表现。通过人体组织解剖试验可以将黄韧带从解剖层面分为三个部分研究,即背侧部、中间部和腹侧部。其中浅层背侧部附着于椎板,深层腹侧部因邻接硬脊膜而称硬脊膜部,中间部为深浅两层之间的移行部分。既往研究表明有多种因素参与了黄韧带增生肥厚的病变过程。衰老是一重要因素,随着人年龄的增长,黄韧带发生退变,内部弹性纤维减少、胶原含量增多,黄韧带产生增生肥厚样改变。随着腰椎椎体节段的增加,黄韧带的厚度也随之增厚,但在L5S1节段,黄韧带厚度又随之下降；力学因素是导致黄韧带增生肥厚的另一原因,正常人体脊柱在屈伸活动中,黄韧带会受到不断的牵拉,其背侧部受到的牵拉力较腹侧部大；同时伴随着人体的老龄化,脊柱失稳或椎体退行性变产生的机械性应力也会刺激黄韧带产生增生肥厚；某些生长因子和细胞因子的异常表达也参与了黄韧带的增生肥厚,如结缔组织细胞表达的转化生长因子-β(TGF-β),与黄韧带增生肥厚早期相关；基质金属蛋白酶-3(MMP-3)在退变性腰椎滑脱患者中的黄韧带中表达增高；基质金属蛋白酶组织抑制因子-2(TIMP-2)在腰椎管狭窄患者黄韧带中表达显著高于腰椎间盘突出患者黄韧带；而骨形态发生蛋白(BMP-2)在腰椎管狭窄症中与黄韧带钙化、骨化相关。但对TGF-β、MMP-3、TIMP-2和BMP-2的研究均无法完全解释黄韧带增生肥厚的病理机制。已有研究表明黄韧带增生肥厚是长期脊柱屈伸力造成的韧带退化。机械应力,特别是躯体屈曲运动,会引发黄韧带微结构的损伤。既往研究发现部分手术切除的黄韧带中可见散在的含铁血黄素,这表明黄韧带有过损伤或血管破裂出血,受脊柱牵拉力负荷最大的背侧部最易受损伤。在损伤修复的过程中,产生瘢痕反应,而脊柱不断活动形成的刺激,对黄韧带的损伤修复是一个累积渐进的过程,从而导致瘢痕不断形成,最终形成黄韧带增生肥厚；同时在增生肥厚的黄韧带中发现COX-2酶,这种环氧合酶在机体产生炎性反应时表达,针对黄韧带增生肥厚导致的腰椎管狭窄患者进行口服抗炎药物或COX-2酶抑制剂治疗,腰椎管狭窄患者腰腿痛症状明显缓解。从而可以证实,黄韧带增生肥厚部分原因是韧带损伤后导致炎性反应,通过瘢痕组织修复逐步累积形成的。血小板衍生生长因子(platelet derived growth factor, PDGF)能刺激多种细胞如成骨细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞等分裂、增殖,在人体组织修复过程中起到关键性作用。PDGF是成纤维细胞重要的趋化因子,可以诱导成纤维细胞向伤口迁移；同时它又是成纤维细胞的有丝分裂原,促进成纤维细胞分化并诱导成纤维细胞分泌其他细胞因子,促进细胞基质成分(胶原、透明质酸等)的合成、分泌,从而加速伤口的愈合。PDGF有多种亚型和二聚体。其中PDGF-BB通过与细胞表面的PDGF-β受体结合,PDGF-BB在人体多个组织和部位均参与了胶原的合成与分解。由此我们提出假说：人类在日常脊柱过度屈伸活动中,黄韧带受过度屈伸运动损伤后,导致局部出血,血小板凝集,释放PDGF修复损伤的黄韧带,在其不断刺激黄韧带修复的同时,瘢痕反应过度增生导致黄韧带增生肥厚,韧带内部弹性纤维减少,胶原表达增加导致纤维化。因此黄韧带增生肥厚,与PDGF-BB的表达有紧密关系。目的1.探讨腰椎管狭窄患者黄韧带与腰椎间盘突出症患者(Lumbar disc herniation,LDH)正常人体黄韧带相比,PDGF-BB是否存在高表达,及其与黄韧带增生肥厚形成纤维化的相关性。2.探讨人黄韧带细胞的分离与体外培养方法,建立黄韧带细胞系。3.探讨PDGF-BB对人黄韧带细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原表达的影响。方法1.探讨LSS组黄韧带与LDH组黄韧带相比,PDGF-BB是否存在高表达,及其与黄韧带增生肥厚形成纤维化的相关性。(1)黄韧带厚度测量和临床标本搜集收集自2007年9月～2008年4月南方医院脊柱骨病科有腰椎疾患的患者,在Pacs系统中有完整资料共20名纳入研究,经医院伦理委员会批准,全部患者签署知情同意书。其中男11例,女9例；其中腰椎间盘突出症(LDH)患者10例,年龄45～59岁,平均年龄50.50±5.0岁；黄韧带增厚致腰椎管狭窄(LSS)患者10例,年龄40～65岁,平均年龄56.00±7.5岁；两组患者年龄无显著差异(P=0.069)。所有患者均主诉下腰痛或间歇性跛行病史；强直性脊柱炎、脊柱侧凸、椎体压缩骨折等脊柱畸形患者排除在研究之外。在Pacs系统中MR的T1轴位加权像下测量黄韧带厚度；行腰椎管狭窄后路椎板减压术中和腰椎间盘突出症髓核摘除术中取黄韧带标本；取材部位：L3-L4、L4-L5, L5-S1;所有黄韧带标本均取自椎板部的中央部分(椎板间部)。(2) Masson三色染色鉴定对比两组黄韧带纤维化差别在低倍镜(×10)下观察Masson三色染色法切片。弹性纤维显示为粉红色,胶原显示为蓝色。纤维化评分为5级(0-4)。纤维化0级：显示组织内全部为粉红色弹性纤维；纤维化1级：胶原表达≤25%；纤维化2级：胶原表达>25%并≤50%；纤维化3级：胶原表达>50%并≤75%；纤维化4级：胶原表达>75%,视野内基本为蓝色胶原表达。(3)天狼猩红-偏振光染色鉴定导致黄韧带纤维化的胶原类型脱蜡前,组织切片置于60℃恒温箱中烘烤20min；组织切片二甲苯Ⅰ浸泡10min二甲苯Ⅱ浸泡10min;乙醇逐级复水ddH2O浸泡3min;流水冲洗10min;蒸馏水漂洗；用0.2%磷钼酸水溶液处理(1-5min)；0.1%天狼猩红饱和苦味酸溶液染色90min；0.01N盐酸漂洗2min；在70%酒精中冲洗45秒；逐级脱水透明,二甲苯Ⅰ浸泡5min,二甲苯Ⅱ浸泡5min。中性树胶封片。在偏振光显微镜下观察Ⅰ型和Ⅲ型胶原结构。(4) PDGFR-β和PDGF-BB在两组黄韧带内定位、定性表达分析人黄韧带标本在10%中性甲醛中固定,石蜡包埋后5μm连续切片。用1：100稀释的PDGFR-β和PDGF-BB ((Millipore, San Antonio, TX, USA)兔多克隆抗体孵育,DAB法显色,人真皮组织做阳性对照,共聚焦显微镜下观察。(5) PDGF-BB在两组黄韧带定量表达分析取6例LDH组黄韧带和6例LSS组增生肥厚黄韧带,LSS黄韧带分为腹侧面、背侧面。采用Western bloting方法检测两组标本PDGF-BB蛋白含量差异；采用Real-time PCR方法检测两组PDGF-BB的mRNA表达含量差异。2.人黄韧带细胞的分离与培养采集腰椎间盘突出症患者后路开窗髓核摘除术中的黄韧带标本。黄韧带标本用PBS液清洗后,剪成大小约0.2mm的碎块,并用0.25%Ⅰ型胶原酶消化液于37℃孵箱中消化90 min。将胶原酶预消化组织块均匀贴附在25cm2细胞培养瓶内,置于37℃、5% CO2、饱和湿度的孵箱中静置8h后,沿孔板侧壁小心加入含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培养液继续培养。培养5-7d后首次更换培养液,随后每隔3天更换。原代细胞从组织块迁出、生长至80%融合时,用含0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA的细胞消化液消化并传代培养。倒置相差显微镜下观察细胞从组织块迁出时间,形态和生长状态。对传3代细胞进行波形蛋白和Ⅰ型胶原的免疫荧光化学染色。3. rhPDGF-BB对人黄韧带细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原表达的影响。(1)黄韧带细胞增殖检测人黄韧带细胞与200ng/ml rhPDGF-BB分别共孵育6,12,24,48,72 h或分别与0,10,50,100,200ng/ml rhPDGF-BB共孵育12h后,四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法分析传细胞增殖特性,绘制细胞生长曲线。(2)黄韧带细胞Ⅰ型胶原mRNA表达的检测人黄韧带细胞与200ng/ml rhPDGF-BB分别共孵育0,6,12,24,48,72 h或分别与0,10,50,100,200ng/ml rhPDGF-BB共孵育12h后,收集细胞,提取细胞总RNA,实时荧光聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测黄韧带细胞的Ⅰ型胶原mRNA表达,以GAPDH为内对照,分析Ⅰ型胶原mRNA相对表达的变化。(3)黄韧带细胞Ⅰ型胶原蛋白表达的检测人黄韧带细胞与200ng/ml rhPDGF-BB分别共孵育0,6,12,24,48,72 h或分别与0,10,50,100,200ng/ml rhPDGF-BB共孵育24h后,收集细胞,提取细胞总蛋白,酶联免疫吸附剂测定法(Elisa)检测黄韧带细胞的Ⅰ型胶原蛋白表达的变化。(4)黄韧带细胞Ⅲ型胶原mRNA表达的检测人黄韧带细胞与200ng/ml rhPDGF-BB分别共孵育0,6,12,24,48,72 h或分别与0,10,50,100,200ng/ml rhPDGF-BB共孵育12h后,收集细胞,提取细胞总RNA,实时荧光聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测黄韧带细胞的Ⅲ型胶原mRNA表达,以GAPDH为内对照,分析Ⅲ型胶原mRNA相对表达的变化。(5)黄韧带细胞Ⅲ型胶原蛋白表达的检测人黄韧带细胞与200ng/ml rhPDGF-BB分别共孵育0,6,12,24,48,72 h或分别与0,10,50,100,200ng/ml rhPDGF-BB共孵育24h后,收集细胞,提取细胞总蛋白,酶联免疫吸附剂测定法(Elisa)检测黄韧带细胞的Ⅲ型胶原蛋白表达的变化。结果1.探讨LSS组与LDH组内PDGF-BB和纤维化表达差异,及其与黄韧带增生肥厚形成纤维化的相关性。(1)LSS组和LDH组两组黄韧带厚度测量对比和患者年龄对比LDH组患者平均年龄50.5±5.0岁,LSS组患者平均年龄56.0±7.5岁,两组对比无统计学差异(P=0.069); LDH组黄韧带厚度2.8±0.7mm, LSS组黄韧带厚度5.3±1.0mm。LSS组黄韧带厚度显著高于LDH组,两组结果有统计学差异(P=0.000)。(2)LDH和LSS两组黄韧带纤维化程度差别LSS组黄韧带整体纤维化程度显著高于LDH组(P=0.0001)；两组纤维化程度在腹侧部、中间部、背侧郡分别对比均有统计学差异；LSS组内背侧部纤维化程度显著高于腹侧部(P=0.000)。(3)天狼猩红-偏振光染色鉴定导致黄韧带纤维化的胶原类型LDH组和LSS组黄韧带胶原鉴定为Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原。(4) PDGFR-β和PDGF-BB在两组黄韧带内定位、定性表达分析PDGFR-β和PDGF-BB在LDH组黄韧带内表达弱阳性；PDGFR-β和PDGF-BB在LSS组黄韧带内表达强阳性,在背侧部散在表达更显著。(5) PDGF-BB在两组黄韧带定量表达分析LSS组黄韧带腹侧部PDGF-BB蛋白表达与LDH组黄韧带对比无显著性差异(P=0.996); LSS组背侧部黄韧带PDGF-BB蛋白表达显著高于LDH组黄韧带(P=0.023); LSS组背侧部蛋白含量显著高于LSS组腹侧部蛋白含量(P=0.023); LSS组黄韧带腹侧部PDGF-BB的mRNA表达与LDH组黄韧带对比无显著性差异(P=0.865); LSS组背侧部黄韧带PDGF-BB的mRNA表达显著高于LDH组黄韧带(P=0.013); LSS组背侧部mRNA含量显著高于LSS组腹侧部mRNA含量(P=0.019)。(6)黄韧带厚度与纤维化程度相关性分析LSS组黄韧带腹侧部、中间部、背侧部黄韧带厚度与相应部位纤维化程度呈显著正相关性,相关系数分别为0.81(P<0.05)、0..77(P<0.05)和0.41(P<0.05)。(7)黄韧带厚度与PDGF-BBmRNA表达相关性分析LDH组、LSS组腹侧部、背侧部黄韧带厚度与相应部位PDGF-BBmRNA表达呈显著正相关性,相关系数为0.41(P=0.000)。(8)黄韧带纤维化程度与PDGF-BBmRNA表达相关性分析LDH组、LSS组腹侧部、背侧部黄韧带纤维化程度与相应部位PDGF-BBmRNA表达呈显著正相关性,相关系数为0.69(P=0.001)。2.人黄韧带细胞的分离与培养(1)倒置相差显微镜观察在培养第10-14d后，部分黄韧带组织块周围开始有细胞迁出,细胞呈多种形态,主要为梭形和多角形,细胞接近融合时,呈放射状生长；传代细胞主要呈长梭形,少许呈扇形或多角形,接近融合时呈涡流状生长；连续传代培养至第5代,细胞仍保持良好细胞形态。(2)波形蛋白和Ⅰ型胶原的免疫荧光染色所有细胞的波形蛋白和Ⅰ型胶原免疫荧光化学染色均呈阳性。3. rhPDGF-BB对人黄韧带细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原表达的影响。(1)黄韧带细胞增殖检测人黄韧带细胞数在100ng/ml rhPDGF-BB分别共孵育6,12,24,48h时与对照组相比有显著差异(P<0.05),72h时与对照组无差异(P>0.05)；人黄韧带细胞数在200ng/ml rhPDGF-BB孵育6,12,24,72h时,与对照组无差异(P>0.05),48h时与对照组相比有显著差异(P<0.05)。(2) rhPDGF-BB诱导黄韧带细胞Ⅰ型胶原mRNA的表达人黄韧带细胞与200ng/ml rhPDGF-BB共同孵育0,12,24,48,72 h后,Real-time PCR检测Ⅰ型胶原mRNA,刺激12小时Ⅰ型胶原mRNA表达最高,与对照组200ng,0h组相比,差异有统计学意义(P<0.01),同时细胞Ⅰ型胶原mRNA表达随干预时间延长而升高,呈时间依赖效应(F=435.865,P=0.000)；人黄韧带细胞与0,10,50,100,200ng/ml rhPDGF-BB共同孵育12h,200ng/ml rhPDGF-BB黄韧带细胞Ⅰ型胶原mRNA表达最高,与对照组0ng,12h组相比,差异有统计学意义(P<0.01),同时又以剂量依赖方式增加黄韧带细胞Ⅰ型胶原mRNA表达(F=103.817,P=0.000)。(3) rhPDGF-BB诱导黄韧带细胞Ⅰ型胶原蛋白的表达人黄韧带细胞与200ng/ml rhPDGF-BB共同孵育0,6,12,24,48,72 h,Elisa检测Ⅰ型胶原蛋白,刺激24小时Ⅰ型胶原蛋白表达最高,与对照组200ng,Oh组相比,差异有统计学意义(P<0.01),同时细胞Ⅰ型胶原蛋白表达随干预时间延长而升高,呈时间依赖效应(F=1478.703,P=0.000)；人黄韧带细胞与0,10,50,100,200ng/ml rhPDGF-BB共同孵育24h,200ng/ml rhPDGF-BB刺激黄韧带细胞Ⅰ型胶原蛋白表达最高,与对照组0ng,24h组相比,差异有统计学意义(P<0.01),同时又以剂量依赖方式增加黄韧带细胞Ⅰ型胶原蛋白表达(F=1127.424,P=0.000)。(4) rhPDGF-BB诱导黄韧带细胞Ⅲ型胶原mRNA的表达人黄韧带细胞与100ng/ml rhPDGF-BB共同孵育0,12,24,48,72 h后,Real-time PCR检测Ⅲ型胶原mRNA,刺激12小时Ⅲ型胶原mRNA表达最高,与对照组100ng,0h组相比,差异有统计学意义(P<0.01),同时细胞Ⅲ型胶原mRNA表达随干预时间延长而升高,呈时间依赖效应(F=914.894,P=0.000)；人黄韧带细胞与0,10,50,100,200ng/ml rhPDGF-BB共同孵育12h, 100ng/mlrhPDGF-BB刺激黄韧带细胞Ⅲ型胶原mRNA表达最高,与对照组0ng,12h组相比,差异有统计学意义(P<0.01),同时又以剂量依赖方式增加黄韧带细胞Ⅲ型胶原mRNA表达(F=136.842,P=0.000)。(5) rhPDGF-BB诱导黄韧带细胞Ⅲ型胶原蛋白的表达人黄韧带细胞与200ng/ml rhPDGF-BB共同孵育0,6,12,24,48,72 h,Elisa检测Ⅲ型胶原蛋白,刺激72小时Ⅲ型胶原蛋白表达最高,与对照组200ng,0h组相比,差异有统计学意义(P<0.01),同时细胞Ⅲ型胶原蛋白表达随干预时间延长而升高,呈时间依赖效应(F=848.137,P=0.000)；人黄韧带细胞与0,10,50,100,200ng/ml rhPDGF-BB共同孵育72h,200ng/ml rhPDGF-BB刺激黄韧带细胞Ⅲ型胶原蛋白表达最高,与对照组0ng,72h组相比,差异有统计学意义(P<0.01),同时又以剂量依赖方式增加黄韧带细胞Ⅲ型胶原蛋白表达(F=10184.74,P=0.000)。结论1.黄韧带增生肥厚导致的腰椎管狭窄,其韧带纤维化与PDGF-BB的高表达呈显著相关；2.组织块加酶消化法原代培养的黄韧带细胞,鉴定呈成纤维细胞表型特征；3. rhPDGF-BB体外诱导人黄韧带细胞表达构成纤维化的Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原。