温度是影响植物生长和分布的重要因素。周期性寒害往往引起柑橘果实产量降低、品质下降,甚至树体死亡,从而造成巨大的经济损失。迄今为止,全球的柑橘冻害问题仍然没有得到有效解决。因此培育柑橘的抗寒品种成为柑橘业中一个急需解决的问题。随着植物分子生物学的发展,转基因已成为农作物育种新的技术,植物的抗寒性状是复杂的数量性状,是低温下多基因共同协作的结果。若采用单一的抗寒基因转化植物,虽然能一定程度上提高转基因植物的抗寒性,但实际效果并不理想。CBF是一种调控一系列植物冷驯化相关基因表达的转录因子,在低温下迅速合成,与相应顺式作用元件CRT/DRE结合,诱导冷相关基因的表达,进而合成糖类、脯氨酸和膜稳定蛋白等物质,提高植物的抗寒性。因此,利用CBF转化柑橘有望成为培育柑橘抗寒新品种的有效途径。枳由于具有抗性强、树形矮小等特点,是柑橘的常用砧木。枳也是柑橘中抗寒性最强的品种,可以耐-20℃。所以研究柑橘的抗寒基因首先研究枳的抗寒基因。为了更好地利用所分离得到的枳CBF基因来提高柑橘的抗寒性,了解其功能特征与表达模式是必要的。研究基因的表达,必须选择合适的启动子。已有研究报道了枳CBF基因及其自身启动子的序列,本研究参考此报道克隆了枳CBF,在其自身启动子的启动下与报告基因GFP构建成融合基因,并构建融合基因表达载体,在农杆菌介导下转入到烟草及枳中,观察枳CBF的时空表达模式。主要试验结果如下:①构建融合基因CG。以枳DNA为模板,将枳CBF及其自身启动子作为一个完整的序列克隆出来,扩增产物5′端引入EcoRI酶切位点,3′端引入SalⅠ酶切位点。以PMV质粒为模板,扩增GFP,在5′端引入SalⅠ酶切位点,在3′端增加BstpⅠ酶切位点。将扩增的CBF与GFP序列分别用SalⅠ进行单酶切、连接。在此过程中注意融合基因移码问题,扩增产物经测序验证为目的融合基因,命名为CG。全长为2.4 kb,是一个由枳CBF基因自身启动子、枳CBF与GFP构成的融合基因。②构建融合基因表达载体CG2301。以表达载体pCAMBIA2301为基础载体,用EcoRⅠ、Bstp分别双酶切pCAMBIA2301与融合基因CG后,T4 ligase连接,构建成融合基因表达载体CG2301。此载体含枳CBF与GFP的融合基因CG,并由枳CBF自身启动子启动表达,为Kan抗性。③融合基因表达载体CG2301在农杆菌介导下采用叶盘法转化烟草,获得了43棵生根的抗性苗,经PCR鉴定,获得13株转基因烟草。④融合基因表达载体CG2301在农杆菌介导下采用上胚轴转化枳,取其中的14株抗性芽进行PCR鉴定,获得2株转基因枳。⑤研究融合基因CG在烟草中的表达模式。将转基因烟草在4℃与-5℃温度处理不同的时间后,通过荧光显微镜观察基因在不同的器官中的表达情况。结果表明,荧光首先在根系表达(在4℃下2h、-5℃下15min即可检测到),其次是在叶片(4℃下12h、-5℃下15min有少量荧光),茎中的表达最晚(4℃下48h、-5℃下30min有少量荧光)。在叶片中荧光首先出现在叶脉处,随着处理时间的增加,表达量也在增加,若叶片出现伤口,则伤口周围会检测到大量的荧光。在根和茎中同样随着低温处理时间的增加荧光量不断加强。