论文部分内容阅读
目的庆大霉素等氨基糖苷类药物对内耳的毒性作用可通过破坏毛细胞而引起的听力和平衡功能受损表现出来。但庆大霉素对椭圆囊感觉上皮的破坏程度和抑制FGF信号通路对过表达Atoh1/Math1基因引起毛细胞再生的调控作用仍有待详细论述。本研究拟解决问题：1.利用统计学方法对庆大霉素处理小鼠椭圆囊不同时间段引起的微纹区和非微纹区毛细胞损伤程度和细胞增殖程度进行研究；2.抑制FGF信号通路对Ad-Math1诱导小鼠椭圆囊感觉上皮区域与非感觉上皮区域内细胞增殖和毛细胞样细胞产生的调控作用；3. Ad-Math1诱导产生的新生毛细胞样细胞是否具有细胞平面极性及其调控机制研究。方法本研究使用庆大霉素建立体外培养椭圆囊毛细胞的损伤模型。于不同时间段观察庆大霉素对椭圆囊微纹区和非微纹区内Phalloidin标记的毛细胞纤毛和毛细胞特异性抗体MyosinⅦa阳性细胞的破坏程度；以及通过增殖细胞EdU特异性染色观察感觉上皮和非感觉上皮的细胞增殖情况。之后,利用激光共聚焦和SPSS软件从形态学和统计学角度验证和分析庆大霉素对毛细胞的破坏和细胞增殖的作用。通过含有Atoh1/Mathl基因的腺病毒载体(Ad-Math1)转染小鼠体外培养椭圆囊组织以促进毛细胞样细胞产生。对转病毒后不同时间点标本进行固定和免疫组织化学染色,验证过表达Atohl/Math1基因对感觉上皮和非感觉上皮细胞增殖情况、新生毛细胞样细胞产生数量和规律的影响。与此同时,FGF信号通路阻滞剂与加入Ad-Math1和／或庆大霉素的椭圆囊组织共培养,观察其对新生毛细胞样细胞的调控作用。最后应用观察细胞平面极性的抗体Spectrin、γ-tubulin对Ad-Math1转染的椭圆囊标本进行免疫荧光染色,观察新生毛细胞样细胞的细胞平面极性规律。结果通过免疫荧光染色的形态学和SPSS的统计学方法研究表明,体外培养新生小鼠前庭椭圆囊在庆大霉素处理后最早出现毛细胞纤毛损伤,以微纹区较明显；毛细胞特异性标记物MyosinⅦa阳性的细胞随着时间的延长逐渐减少；标记毛细胞前体细胞的Sox2阳性细胞在微纹区中随着时间的延长逐渐增多。同时,椭圆囊感觉上皮区域在庆大霉素处理后增殖细胞较对照组明显增多,但随着用药剂量的增加,增殖细胞逐渐减少。Ad-Math1和庆大霉素共同作用椭圆囊组织后,感觉上皮区域细胞增殖较单纯加入庆大霉素或Ad-Math1组多,且主要位于微纹区。当同时加入FGF阻滞剂SU5402时,增殖细胞无明显增多,但感觉区域与非感觉区域毛细胞特异性标记物MyosinⅦa阳性细胞,即新生毛细胞样细胞较单纯加入Ad-Math1组增多。新生毛细胞样细胞动纤毛从细胞表面中央逐渐移向一侧,且标记毛细胞纤毛极性的特异性标记物Spectrin和γ-tubulin染色显示感觉上皮区域新生的毛细胞样细胞与原位存在的毛细胞平面极性方向一致,即纤毛延极性分界线相对排列。而非感觉上皮区域新生毛细胞样细胞极性紊乱。结论庆大霉素处理体外培养小鼠椭圆囊可导致毛细胞的损伤,并伴有感觉上皮和非感觉上皮细胞增殖能力增强。当过量表达Atoh1/Math1基因可促使椭圆囊感觉上皮和非感觉上皮区域细胞转化为毛细胞样细胞。抑制FGF信号通路可促进Ad-Math1介导的椭圆囊组织新生毛细胞样细胞数量增多,却对细胞增殖无明显调控作用。新生毛细胞样细胞纤毛形成规律类似胚胎期纤毛形成规律,且感觉上皮区域新生的毛细胞样细胞与原位存在的毛细胞平面极性方向一致,而非感觉上皮区域新生毛细胞样细胞无统一极性。