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黄芩汤是中医经典著作《伤寒论》中著名的方剂,由黄芩、芍药、炙甘草和大枣配伍组成,具有清热止痢、和中止痛的功效。临床上常应用于治疗细菌性痢疾、阿米巴痢疾、急性胃肠炎、溃疡性结肠炎等胃肠道疾病。现代药理研究表明黄芩汤具有明显的抑菌、抗炎、解痉止痛和保肝等作用,但其药效学及临床研究还不够深入,作用机制尚不明确。本文从整体动物和细胞两个层面,采用溃疡性结肠炎大鼠模型和RNAi Caco-2细胞模型,对黄芩汤治疗溃疡性结肠炎的抗氧化应激作用及其机制进行了初步探讨,为黄芩汤的临床应用和进一步的开发提供科学依据。研究目的：1、建立溃疡性结肠炎大鼠模型,并观察黄芩汤对其的治疗作用,以明确黄芩汤的抗氧化应激作用。2、观察黄芩汤对Caco-2细胞的抗氧化应激作用。3、建立siRNANrf2干扰的Caco-2细胞模型,并观察黄芩汤对siRNANrf2干扰的Caco-2细胞模型的影响,以探讨黄芩汤通过调控Nrf2通路的抗氧化应激作用。研究方法：]、黄芩汤对溃疡性结肠炎大鼠的氧化应激的相关研究健康雄性SD大鼠,运用三硝基苯磺酸与乙醇混合的复合法制备细胞免疫反应性溃疡性结肠炎大鼠模型,溃疡性结肠炎大鼠模型成功建立后,根据体重,将大鼠随机分为黄芩汤高剂量组(20 g/kg)、中剂量组(10 g/kg)、低剂量组(5g/kg)、阳性药组(SASP,0.5 g/kg)、模型组,另设健康大鼠为正常组,每组7只。造模后第3天开始灌胃给药,每天一次,连续治疗5天。观察各组大鼠体重、饮食及状态的变化,治疗5d后所有大鼠眼眶取血、剖腹取结肠,采用HE染色法观察大鼠结肠组织变化,采用生化法测定血清中GSH-px、CAT、SOD、MDA的含量,ELISA法测定血清中LPO的含量,免疫组织化学法检测结肠组织中Nrf2蛋白的表达量,Western Blot法测定各组大鼠结肠组织中HO-1、NQO1蛋白的变化。2、黄芩汤对Caco-2细胞的氧化应激作用的影响取处于对数生长期的Caco-2细胞,接种于6孔板中,每孔约含2×105细胞。采用不同浓度的黄芩汤及SFN干预正常的Caco-2细胞36 h,去除上清液,使用Trizol提取RNA,利用RT-PCR技术检测HO-1、NQO1、GST、Keap1、Nrf2 mRNA的表达,同理,按上述方法,使用蛋白裂解液提取蛋白,利用生化法检测其SOD、MDA、GSH-px的表达,利用荧光探针DCFH-DA检测其ROS的相对表达,利用Western Blot法检测其HO-1、NQO1、GST、Keapl蛋白的表达。3、黄芩汤对Nrf2基因干扰后Caco-2细胞内的抗氧化应激作用的影响3.1靶向Nrf2基因的siRNA Caco-2细胞的构建和鉴定按照Genebank中Nrf2的序列,根据Tuschl设计原则由吉玛公司设计合成3对siRNA序列,1对通用阴性对照(Negative control, NC)序列,1对GAPDH阳性对照。转染前一天,将细胞接种于6孔板中,每孔约含2×105细胞,采用Lipofectamine 2000与siRNA融合,转染Caco-2细胞,培养36 h,采用RT-PCR检测转染后Caco-2细胞Nrf2mRNA的表达,采用Western Blot法检测转染后Caco-2细胞Nrf2蛋白的表达。3.2黄芩汤对siRNA Caco-2细胞的氧化应激的影响取处于对数生长期的Caco-2细胞,接种于6孔板中,每孔约含2×105细胞。按照上述方法转染各实验组6h,采用不同浓度的黄芩汤及SFN干预转染后的Caco-2细胞36h,去除上清液,使用Trizol提取RNA,利用RT-PCR技术检测HO-1、NQO1、GST、Keap1、Nrf2 mRNA的表达,同理,按上述方法,使用蛋白裂解液提取蛋白,利用生化法检测其SOD、MDA、GSH-px的表达,利用荧光探针DCFH-DA检测其ROS的相对表达,利用Western Blot法检测其HO-1、NQO1、GST、Keap1蛋白的表达。研究结果：1、黄芩汤对溃疡性结肠炎大鼠的治疗及抗氧化应激作用造模后,大鼠出现便血、便稀、懒动、毛发晦暗无光泽、体重以及饮食下降等症状,结肠组织出现明显溃疡,揭示造模成功。同时,HE结果显示,其结肠组织出现不同程度的变化。与正常组相比,模型组血清中SOD、CAT、GSH-px的含量减少且有显著性差异(P<0.05或P<0.01),MPO、LPO的含量增加有显著性差异(P<0.05或P<0.01),结肠组织Nrf2、HO-1、NQO1蛋白的表达稍有增加。经SASP和黄芩汤干预后,各给药组大鼠的精神状况有不同程度的改善。黄芩汤各剂量组大鼠的饮食量和体重有所增加,血清中SOD、CAT、GSH-px的含量较模型组均有不同程度的增加,血清中MPO、LPO的含量较模型组有所减少,结肠组织Nrf2、HO-1及NQO1蛋白的表达量较模型组也均有增加。2、黄芩汤对Caco-2细胞的氧化应激作用的影响与正常组相比,SFN组与HQT 400μg/ml可降低Caco-2细胞内的ROS、MDA含量,且有显著性差异(P<0.05或P<0.01); SFN组与HQT各剂量组均能增加细胞内SOD含量,且SFN组与HQT 400 μg/ml有显著性差异(P<0.05或P<0.01); SFN组与HQT高、中、低剂量组均能增加细胞内GSH-px的含量,且具有显著性差异(P<0.05或P<0.01),且给药后,各组的GST, HO-1、NQO1、 Keapl、Nrf2 mRNA和其蛋白的含量均有增加,说明黄芩汤具有抗氧化应激的作用。3、黄芩汤对Nrf2基因干扰后Caco-2细胞内的抗氧化应激作用的影响3.1靶向Nrf2基因的siRNA Caco-2细胞的构建和鉴定转染靶向Nrf2的siRNA后,与空白对照组比较,3个siRNA片段对Nrf2均有明显的抑制作用,R.T-PCR的结果显示其抑制率分别60.55%,70.83%,45.33%,其中Nrf2-821 siRN片段抑制率最高,故将其可作为目标靶序列。并且其Western Blot结果显示,上述处理对Nrf2蛋白表达有一定的干扰。说明靶向Nrf2基因的siRNA Caco-2细胞的构建成功,为下一步黄芩汤对其的靶向治疗提供了实验依据。3.2黄芩汤对siRNA Caco-2细胞氧化应激的影响转染Nrf2 siRNA后,与正常组相比,模型组的ROS、MDA增加,SOD、GSH-px及GST、HO-1、 NQO1、Keap1 mRNA及蛋白均有不同程度的减少,给药后,与模型组相比,各给药组SOD、GSH-px的含量有不同程度的增加,SFN组与HQT 400 μg/ml的ROS、MDA含量均有不同程度的降低；Western Blot结果显示,GST、HO-1、NQO1、Keap1、Nrf2的蛋白表达均有不同程度增加；RT-PCR结果显示,GST、HO-1、NQO1、Keapl、Nrf2 mRNA的表达均有不同程度增加,揭示Nrf2通路在氧化应激中起着重要作用,黄芩汤通过Nrf2通路对其氧化应激进行调节。研究结论：1、黄芩汤通过增加SOD、CAT、GSH-px、HO-1和NQO1等Ⅱ相解毒酶和抗氧化物酶的表达,减少MPO、LPO的含量而发挥抗氧化应激作用。2、黄芩汤可通过促进Nrf2的活化进而上调Ⅱ相解毒酶和抗氧化物酶的表达。3、成功构建了靶向Nrf2的siRNA的Caco-2细胞,并发现黄芩汤可对Nrf2siRNA的Caco-2细胞有上调Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶的作用。