第一部分外周血中HCMV-MIR-UL112-3p水平与颈动脉IMT增加的相关性1研究背景动脉粥样硬化是一种进行性疾病,以脂质和纤维成分在动脉中聚集为主要特征。炎症反应在动脉粥样硬化发生过程中发挥重要作用,是引起心血管疾病的最重要原因,包括中风、心肌梗死、心力衰竭和血管瘤等。流行病学研究表明动脉粥样硬化存在多种危险因子,然而动脉粥样硬化的发病机制和病因尚不完全清楚。人巨细胞病毒（Human Cytomegalovirus,HCMV）属于疱疹病毒β亚科,为双链DNA病毒。在全球范围成人血清抗体阳性率为60-90%以上,与所有的疱疹病毒一样,一旦发生感染,HCMV会在宿主体内（唾液腺、白细胞等处）建立持续终生的潜伏感染,潜伏感染常会间断性地被激活而发生再激活感染。血管系统中的HCMV感染与心血管疾病如动脉粥样硬化、再狭窄和移植血管硬化,均存在相关性。HCMV可通过改变细胞粘附分子的表达、诱导内皮功能障碍和干扰细胞因子信号来加重病变血管的炎症反应。抗病毒药物更昔洛韦已被证明能降低心脏移植相关的动脉粥样硬化发生。HCMV编码至少26个成熟的mi RNA,但这些mi RNA与临床病理的相关性仍不确定。HCMV-mir-UL112-3p（mi R-UL112-3p）是HCMV编码的mi RNA中研究最广泛的一种,可以靶向调控宿主细胞和病毒转录。先前的研究表明,在高血压患者中,mi R-UL112-3p是唯一高表达的循环型HCMV编码mi RNA,并且它与高血压风险的增加有关。此外,有研究显示血浆HCMV-Ig G或抗CMV抗体水平与动脉粥样硬化有关,而另一些临床研究则发现HCMV感染与动脉粥样硬化之间的相关性不强。在本研究中我们检测了动脉粥样硬化患者血浆/血清中的mi R-UL112-3p和HCMV Ig G水平,同时通过颈动脉超声检查患者内膜中层厚度（IMT）,分析mi R-UL112-3p和HCMV Ig G、Ig M水平与IMT之间的关系,评估HCMV感染与动脉粥样硬化的相关性。2研究目的通过回顾性调查分析动脉粥样硬化患者颈动脉IMT和外周血炎性细胞因子水平与外周血中HCMV Ig G、Ig M和mi R-UL112-3p水平之间的关系,评估HCMV感染与动脉粥样硬化的相关性。3研究方法3.1研究对象和检测方法招募2012年9月至2016年6月在安徽医科大学第一附属医院心内科、神经内科、内分泌科就诊的颈动脉粥样硬化患者458名,收集患者临床资料,包括年龄、性别、糖尿病史、体重指数（BMI）、吸烟史和高血压史。抽血检测空腹血糖（FBG）、餐后血糖（PBG）、总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、T3、游离T4和促甲状腺激素（TSH）。通过颈动脉超声检查患者IMT值。通过荧光定量PCR（Polymerase Chain Reaction）检测外周血中mi R-UL112-3p的拷贝数,使用梅里埃酶联荧光试剂盒分析（ELFA）HCMV Ig M和Ig G水平,使用ELISA试剂盒检测血浆中TNF-α、IL-6和IL-1β的水平。3.2统计学分析采用Excel 2007建立数据库,SPSS 16.0进行统计分析,正态分布定量资料采用均数标准差进行描述,组间比较采用t检验或方差分析。定性资料采用构成比或频率进行描述,组间比较使用χ2检验。对于IMT值的以高于平均IMT值定义为“高”。为了确定独立的风险因素和高IMT的优势比（OR）,置信区间（cis）设为95%,采用多元逻辑回归模型,包括mi R-UL112-3p阳性率、HCMV Ig G滴度、Framingham评分以及IL-1β含量的对数、TNF-α含量的对数和IL-6含量的对数,单变量分析P<0.05,以确保没有显著的多重共线性。利用单一的线性单变量相关（Pearson相关系数）和逐步多变量回归分析来评价抗HCMV Ig G抗体滴度和其它变量的值之间关系。以P<0.05为差异有统计学意义。4研究结果共458名参与者被纳入研究,其中247人（53.9%）被指定为高（IMT）组。多变量logistic回归分析显示高IMT的四个独立危险因素分别是mi R-UL112-3p阳性（OR 1.05,95%CI 1.01-1.07;P=0.004）,抗HCMV抗体滴度高（OR 1.04,95%CI 1.01-1.06;P=0.003）,Framingham评分高（OR1.14,95%CI 1.02-1.27;P=0.018）,高IL-1β含量（OR 2.96,95%CI 1.26-6.97;P=0.013）。多变量相关性分析显示mi R-UL112-3p阳性率与最大IMT（r=0.328,P<0.001）、游离T4水平（r=0.247,P=0.032）和对数（TNF-α）（r=0.509,P<0.001）显著正相关。5研究结论本研究首次评估了颈动脉粥样硬化与亚洲人群中mi R-UL112-3p阳性率之间的相关性。研究结果表明HCMV与动脉粥样硬化存在相关性。第二部分HCMV通过MMP-2促进内皮-间质转化后脐静脉内皮细胞中的TGF-β1活化1研究背景HCMV属于疱疹病毒β亚科（β-herpesvirus）,为双链DNA病毒。世界范围内HCMV感染非常普遍,在成年前大部分人群均已感染,一旦感染病毒将终身存在于宿主体内。现已发现HCMV与多种心血管疾病,如动脉粥样硬化（AS）、冠心病和高血压存在联系,此外HCMV感染还与血管内皮细胞功能障碍有关。血管内皮细胞能够参与心血管疾病的多种生理和病理过程。内皮功能障碍以及与其相关的心血管疾病是由于内皮细胞间质转化（End MT）引起的。在End MT过程中,内皮细胞（ECs）失去特异性血管内皮标记物如血管内皮钙粘蛋白（VE-cadherin）和白细胞分化抗原31（CD31）,获得间质细胞标志物α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、成纤维细胞特异性蛋白1（角蛋白）和纤维连接蛋白,获得迁移性、侵袭性和增殖性表型。End MT的发生受到多种细胞因子的调节,其中TGF-β1（Transforming growth factor-β1）是End MT发生的关键细胞因子,同时也是血管病理生理过程中重要的细胞因子。TGF-β1的表达水平升高能够促进心血管疾病的发生,如引起肺动脉高压（PAH）和动脉粥样硬化,阻断TGF-β1的表达可以抑制PAH过程和不稳定AS斑块形成。在人成纤维细胞中HCMV感染5h后即可由HCMV IE基因激活TGF-β1启动子,使TGF-β1的表达量提高4倍。此外,TGF-β1可以被蛋白酶（plasmin）、金属蛋白酶（MMPs）、血小板反应蛋白-1（TSP-1）、αvβ6和αvβ8激活,由无活性状态转变为高活性状态。因此,我们推测HCMV感染可能引起血管内皮细胞中TGF-β1表达水平提高或激活潜伏的TGF-β1,使得血管内皮细胞出现End MT,参与动脉粥样硬化的发生。2研究目的观察HCMV感染对血管内皮细胞End MT的影响,讨论HCMV感染参与动脉粥样硬化发生和进展的可能分子机制。3研究方法3.1细胞和病毒培养脐静脉内皮细胞（Human Umbilical vein endothelial cells,HUVEC）用含有BFGF（20 ng/ml）、EFG（10 ng/ml）和人血浆纤连蛋白（10μg/ml）的Human Endothelial-SFM（Life Technologies,Carlsbad CA,USA）无血清培养基进行培养。HELF和水貂肺上皮细胞用含10%胎牛血清（Life Technologies,Carlsbad CA,USA）的DMEM培养基（Life Technologies,Carlsbad CA,USA）培养。HCMV TR株病毒在HELF细胞上传代培养,将病毒培养物上清通过4℃,16000×g离心2h,用Human Endothelial-SFM培养液重悬病毒,并分装冻存于-80℃。对于紫外线灭活病毒,将病毒置于无菌交联小室（Bio-Rad,Hercules CA,USA）中用150 m J的紫外线照射。3.2病毒滴度检测在96孔细胞培养板中每孔加入2.5×104个HELF培养过夜;次日,每孔加入100μl稀释后的病毒悬液,在37℃,5%CO2培养箱中培养过夜;次日,弃去培养液,用PBS洗涤3次,每孔加入无水乙醇50μl室温固定20min,弃去无水乙醇,立即用PBS水化15min;用PBS洗涤3次,每孔加入20μl稀释好的HCMV IE单克隆抗体,室温孵育2h;用PBS洗涤3次,每孔加入20μl稀释好的山羊抗小鼠Ig G-FITC,室温孵育1h;用PBS洗涤3次,每孔加入用PBS配制的70%甘油20μl,于倒置荧光显微镜下观察。根据以下公式计算感染单位（in infectious units/ml）),IU/ml=IE阳性信号数×10×1×稀释倍数。3.3间接免疫荧光细胞爬片至盖玻片上,按照MOI=1接种HCMV TR,加入或不加入ra TGF-β1孵育5d或48h,用4%的多聚甲醛固定,再于0.1%的Triton X-100透化。向细胞中加入一抗4℃孵育过夜,洗涤,与Alexa Fluor 488或Alexa Fluor 594标记的二抗室温孵育1h,加入Alexa Fluor 488标记的鬼笔环肽和4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）,或单独使用DAPI室温孵育15min,洗涤后封片,在荧光显微镜（Olympus Fluoview BX51,Center Valley PA）下观察。3.4蛋白质印迹法（Western Blot）裂解细胞,取30μg总蛋白用的10%的SDS-PAGE胶进行电泳,使用半干式转膜仪（Bio-Rad）转移至PVDF膜上。将膜置于5%脱脂奶粉溶液中室温封闭2h,加入适当稀释的一抗4°C孵育过夜,洗涤后加入适当稀释的辣根过氧化物酶（HRP）标记二抗室温孵育1h。将膜洗涤3次后在膜上涂布ECL发光液,在化学发光成像仪上观察结果。3.5 RNA提取、逆转录和荧光定量PCR检测收集细胞,用RNeasy kit提取总RNA,使用RT2 First Strand Kit将RNA反转录成c DNA,所有操作按照说明书进行。通过荧光定量PCR检测目的基因的表达水平,以18S RNA作为内参进行标化。3.6 TGF-β1含量检测分别使用水貂肺上皮细胞报告基因生物测定法和ELISA试剂盒测定细胞培养上清中总TGF-β1和活化TGF-β1的含量。3.7免疫共沉淀用预冷含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液裂解细胞,加入MMP-2抗体,4℃孵育过夜,再与protein A-agarose孵育,用RIPA裂解液洗涤并重悬,加入SDS-PAGE上样缓冲液,煮沸,用8%的SDS-PAGE胶进行电泳,保留免疫共沉淀前的细胞裂解液作为对照。使用TIMP-2,MT1-MMP和MT3-MMP分别对免疫共沉淀前、后的细胞裂解液进行Western blot检测。3.8 sh RNA转染将MMP-2 sh RNA及其对照质粒通过Amaxa cell line nucleofector Kit V转染HUVEC细胞,24h后在荧光显微镜下观察到细胞出现明显的绿色荧光时,即可判定为转染成功。转染步骤参考试剂盒说明书进行。3.9统计学分析所有分析在Prism 5.0软件上进行。使用Student T test和one-way analysis of variance（ANOVA）比较不同组间差异,以P<0.05表示差异有显著性。4.研究结果1)HCMV可以在HUVEC细胞中增殖但不受ra TGF-β1的影响;2)HCMV能够感染被TGF-β1诱导发生EndMT的HUEVC;3)HCMV可以诱导发生EndMT的HUEVC细胞中TGF-β1活化;4)细胞中新合成活化TGF-β1的量与TGF-β1及HCMV的感染量呈正相关;5)MMP-2参与了HCMV感染引起发生EndMT的血管内皮细胞上调活化TGF-β1。5研究结论在本研究中我们发现感染HCMV的脐静脉内皮细胞与未感染细胞一样,在经过TGF-β1处理后出现End MT相关的形态和基因表达变化。感染HCMV的HUEVC细胞,经TGF-β1处理后,可以通过激活MMP-2活化细胞外潜伏状态的TGF-β1。HCMV感染不会阻止或减少TGF-β1诱导的End MT,相反可以上调发生End MT的细胞中大量纤维化分子的表达,这可能是HCMV影响动脉粥样硬化发生发展的分子机制之一。