研究背景: 蛋白质组学的发展虽只有短短的十年历史,但是它已从对组织和全细胞的分析深入到了对各种亚细胞结构的研究。亚细胞蛋白质组学的提出是生命现象研究向深层次发展的必然结果,只有弄清楚各种亚细胞结构的蛋白质组成、功能及其相互联系,才能最终阐释生命现象的本质。基于目前蛋白质组学分离技术的现状,亚细胞蛋白质组的分析也是一种现实的选择,同时获得更多关于低丰度蛋白质的表达信息,以及蛋白质在亚细胞结构之间转移、相互作用的信息。 研究目的: 本课题以肝癌细胞为研究模型,使用亚细胞蛋白质组学的研究策略和技术方法,对比分析肝癌细胞与正常肝细胞线粒体、细胞核、细胞质蛋白质组的表达差异,以及表阿霉素干预前后肝癌细胞线粒体、细胞核、细胞质蛋白质组的表达差异,为肿瘤发生机制和抗癌药物作用机理的解释提供亚细胞层面的信息。 研究的策略和方法: 1.亚细胞组分的分离纯化:首先使用差速离心将细胞匀浆分离为 1000g沉淀(富含细胞核)、20000g 沉淀(富含线粒体)、100000g 沉淀、100000g 上清(细胞质蛋白)四个组分,然后用密度梯度离心从 1000g 沉淀中纯化出细胞核,从 20000 g 沉淀中纯化出线粒体。 2.双向电泳及图像分析: IPG(immobilized pH gradient)双向电泳分离细胞核、线粒体、细胞质、20000 g 沉淀、100000g 沉淀五个亚细胞组分的蛋白质,ImageMaster 2D(V2002.1)软件进行图像分析,筛选出肝癌细胞细胞核、线粒体、细胞质的差异表达蛋白斑点(以正常肝细胞为对照),以及表阿霉素干预后肝癌细胞的差异表达蛋白斑点(以表阿霉素干预前为对照)。 3.质谱和生物信息学鉴定蛋白质:候选差异表达蛋白斑点经胶内胰酶酶解,MALDI-TOF-MS 分析,得到肽质指纹图谱(peptide mass fingerprinting, PMF),使用 Mascot 和 PeptIdent 二种方法在 Swiss-prot数据库中检索鉴定蛋白质,二者相互映证,提高鉴定准确性。 实验结果: 1、肝癌细胞样品经差速超离心分为细胞核、20000g 沉淀、100000g 沉淀、细胞质四个组分后,其双向电泳分别得到 260、464、340、397 个左右的蛋白质斑点,四个组分一共为 1461 个左右的蛋白斑点,远远高于肝癌全细胞匀浆样品的 870 个斑点。并发现,线粒体、细胞核蛋白质在全细胞电泳图谱中基本未得到显现。 2、在细胞核、线粒体、细胞质的差异比较分析中,2-DE 确认的差异表达蛋白斑点为 117 个,成功鉴定了 58 个差异表达蛋白,它们分属于43 种蛋白(少数蛋白质对应凝胶上的多个蛋白斑点,代表了蛋白质的不同翻译后修饰状况)。