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目的肝癌是广西居民最常见的恶性肿瘤。饮用水污染,尤其是微囊藻毒素污染,与肝癌的发生发展之间的关系引起人们的广泛关注。最近研究报道肿瘤的发生与长链非编码RNA (Long non-coding RNA,LncRNA)的异常表达有关。微囊藻毒素-LR (Microcystin-LR,MC-LR)是一种可能致癌物,本课题拟通过建立MC-LR致人肝细胞株WRL68恶性转化模型,研究肝细胞恶性转化过程中关键LncRNA的表达水平,观察其动态表达规律,为今后进一步研究LncRNA在MC-LR致癌机制中的作用提供科学依据。方法采用l0nmol/L MC-LR连续染毒人肝细胞株WRL68,同时设立同代对照组(含0.01% DMSO浓度的PBS)。每3天传代一次,使细胞始终暴露于l0nmol/L的MC-LR,连续培养至第25代,将不同转化时期的细胞按照传代次数标记为P5、P10、P15、P20和P25;观察不同转化时期细胞形态学的改变;采用MTT、血清依赖实验、软琼脂实验及裸鼠成瘤实验验证不同转化时期的细胞是否发生恶性转化,从而建立MC-LR诱导的人肝细胞株WRL68恶性转化模型;提取不同转化时期细胞及同代对照组细胞总RNA,逆转录成cDNA,并用实时荧光定量PCR (quantitative reverse transcript-polymerase chain reaction,qRT-PCR)法检测长链非编码 RNA(Long non-coding RNA, LncRNA) H19、HOTAIR、HULC、MEG3、AFAP1-AS1的表达水平。结果1.细胞形态学结果显示,与同代对照组相比,P25染毒组细胞核与细胞浆分界不清楚,核仁数量明显增多,细胞边界不光滑,有褶皱,呈浸润型生长。2.软琼脂实验结果显示,培养至第15代时,P15染毒组可以在软琼脂上形成细胞集落,培养至第25代时,P25染毒组形成的细胞集落增多且体积增大,与同代对照组和P15染毒组相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。3. MTT及血清依赖实验结果显示,在正常血清浓度(10% FBS)培养下,P25染毒组细胞生长速度明显快于同代对照组,并且在较低浓度血清(0.5%和1%FBS)培养下,与同代对照组相比,P25染毒组细胞生长速度增快,出现血清不依赖性,差异具有统计学意义(P<0.05)。4.裸鼠成瘤实验结果显示,将P25染毒组细胞接种于裸鼠头颈部皮下,可观察到肿瘤出现,而接种同代对照组细胞和P15染毒组细胞的裸鼠未观察到有肿瘤出现。病理学检查结果显示,瘤组织细胞排列紊乱,核浆比例增大,病理检查显示为恶性程度较高的肝细胞癌。5.不同转化时期细胞H19、HOTAIR、HULC的表达水平:随着染毒时间的延长,染毒组H19、HOTAIR、HULC表达水平逐渐升高(P<0.05)。培养至第25代时,与同代对照组(1.00±0.07)相比,P25染毒组H19表达水平升高至(2.23±0.29);与同代对照组(1.03±0.11)相比,HOTAIR表达水平升高至(3.18±0.18);与同代对照组(1.00±0.16)相比,HULC表达水平升高至(2.26±0.17),差异均具有统计学意义(P<0.05)。6.不同转化时期细胞MEG3、AFAP1-AS1的表达水平:培养至第10代时,与同代对照组相比,P10染毒组MEG3、AFAP1-AS1表达水平上调,培养至第15代时,与同代对照组(1.02±0.06)相比,P15染毒组MEG3表达水平升高至(1.31±0.09);与同代对照组(1.05±0.04)相比,P15染毒组AFAP1-AS1表达水平升高至(1.38 ± 0.09),差异均具有统计学意义(P<0.05)。培养至第20代时,与同代对照组相比,P20染毒组MEG3、AFAP1-AS1表达水平下调。培养至第25代时,P25染毒组MEG3和AFAP1-AS1表达水平分别下降至(0.34±0.05)和(0.50±0.08),差异均具有统计学意义(P<0.05)。7.直线相关分析结果显示,H19与HOTAIR的表达水平呈正相关关系(r=0.90,P<0.05),H19与HULC的表达水平呈正相关关系(r=0.94,P<0.01),HOTAIR与HULC的表达水平呈正相关关系(r=0.95, P<0.01),MEG3与AFAP1-AS1的表达水平呈正相关关系(r=0.99, P<0.01)。结论1.长期低剂量暴露于微囊藻毒素-LR,可诱导肝细胞发生恶性转化。2.在微囊藻毒素-LR致肝细胞恶性转化过程中,H19、HOTAIR、HULC持续高表达,MEG3、AFAP1-AS1在细胞恶性转化前期呈高表达状态,在恶性转化期呈低表达状态,提示H19等关键LncRNA可能参与调控MC-LR的致癌生物学效应。