【研究目的】原发性肝癌(PLC)是全球死亡率最高的恶性肿瘤之一,其死亡率居全球恶性肿瘤的第三位。早期诊断是显著提高肝癌治疗的有效手段。目前,我国常用的肝癌诊断标志物是血清AFP和AFP-L3。由于临床上40%左右肝癌患者AFP水平并不升高,使AFP和AFP-L3的应用大大受限。因此,我们迫切需要寻找其他标志物用于肝癌的早期诊断。AFP-L3是指发生高度岩藻糖基化的AFP,可以与小扁豆凝集素(LCA)特异性结合,又称AFP异质体。早期研究表明,人血清中存在许多糖蛋白也发生类似的岩藻糖基化,这类分子有可能成为肝癌诊断的候选标志物。本课题组在先期研究寻获的一批在肝癌患者血清中与非肝癌患者相比表达量存在明显差异的岩藻糖基化糖蛋白的基础上,拟建立一种基于小扁豆凝集素亲和的ELISA方法直接检测岩藻糖基化糖蛋白,为我们的后期课题奠定基础。同时我们选择其中的Fc-Apo H作为测定的靶蛋白,以观察随着肝癌发生、发展的过程,其表达水平是否逐步降低,并进一步探讨Fc-Apo H作为肝癌诊断新的标志物的可能性,试图为肝癌早期诊断提供一种新的检测方法。【研究方法】1.收集不同患者血清标本,并分为3组:肝癌组(80例)、良性肝病组(57例)和健康人组(52例)共189例。2.采用载脂蛋白H的抗体作为包被抗体,辣根过氧化物酶标记的小扁豆凝集素作为检测物,建立基于小扁豆凝集素的血清ELISA法检测人Fc-Apo H,优化该方法反应条件,并分析该方法的相关性能。3.采用该方法检测患者血清中Fc-Apo H的水平,计算其临界值,分析其诊断肝癌的敏感性和特异性,并与AFP诊断水平进行比较。【研究结果】1.本ELISA反应条件摸索情况如下:1:800稀释包被抗体,1:200稀释酶标小扁豆凝集素,是最适的配伍浓度;最适包被条件是4℃过夜;最适的封闭液是1%BSA的PBST;最适封闭条件是37℃60 min;包被抗体与血清的最适反应条件是37℃60 min;酶标小扁豆凝集素和待测血清的最适反应条件室温下30 min;最适底物反应条件是37℃条件下避光反应15 min。2.本ELISA法检测人Fc-Apo H的大致线性范围78.1ng/ml-1250ng/ml;最低检测限60.02 ng/ml;正常人参考下限为348.1μg/ml。批内、批间变异均小于10%。3.肝癌组血清Fc-Apo H水平(μg/ml)与慢性肝病组、健康人组相比显著降低(P<0.001)。通过受试者工作特征曲线设定327.5μg/ml作为Fc-Apo H诊断肝癌的临界点时,其诊断肝癌的敏感性和特异性分别为77.5%和84.4%,ROC曲线下面积为0.887。4.在本研究肝癌组80名患者血清标本中,血清Fc-Apo H检测肝癌的敏感性(77.5%)明显高于血清AFP检测(62.5%)。【结论】1.初步建立了基于小扁豆凝集素亲和的检测人血清Fc-Apo H的ELISA方法,为研究Fc-Apo H在肝癌血清中的表达水平提供了有效的工具,也为直接检测人血清中其他岩藻糖基化蛋白检测方法的建立提供重要参考。2.人血清Fc-Apo H表达水平在健康人组、慢性肝病组和肝癌组中依次降低,说明Fc-Apo H与肝癌发生、发展密切有关,这种表现形式与以往报道的其他岩藻糖基化蛋白不同。3.本研究建立的方法用于肝癌诊断具有较好的敏感性和特异性,表明Fc-Apo H有可能作为新的候选肝癌诊断标志物。其敏感性高于AFP,有望弥补AFP检测肝癌敏感性较低的不足。