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第一部分应用LC-MS/MS建立测定生物样品中阿法替尼的分析方法目的:建立一种灵敏、高效和专属的LC-MS/MS方法用于测定生物样品中阿法替尼的浓度。方法:色谱柱为Hypersil ODS-C18,流动相为0.1%甲酸水-乙腈（60:40,v/v）,流速为0.4ml/min。采用电喷雾离子源（ESI源）多反应监测（MRM）模式;正离子扫描,486.1→371.1（阿法替尼）,m/z 370.4→288.3（西洛他唑,内标）。结果:阿法替尼的线性范围为1～1000 ng/ml。日内和日间相对标准差均小于15%。结论:该LC-MS/MS方法可以用于阿法替尼生物样品管的浓度检测。第二部分P-gp介导阿法替尼的肠道吸收和胆汁排泄目的:揭示P-gp抑制剂对阿法替尼的肠道吸收与胆汁排泄的分子机制。方法:通过体内吸收实验,原位肠灌流实验,MDCK转染细胞双向转运实验,Caco-2细胞蓄积实验来考察阿法替尼的肠道吸收。通过体内胆汁排泄实验,大鼠原位肝灌流实验,P-gp ATPase酶活性实验,大鼠三明治细胞实验来考察阿法替尼的胆汁排泄。结果:合用维拉帕米后,大鼠体内阿法替尼的血药浓度和AUC都出现明显的升高,达峰时间延长,大鼠胆汁中阿法替尼的排泄量明显降低。提示维拉帕米可增加阿法替尼的肠道吸收并抑制其胆汁排泄。在原位肠灌流和原位肝灌流实验中,维拉帕米同样可以增加阿法替尼的血药浓度,抑制其胆汁排泄。在细胞实验中维拉帕米和环孢素A可以显著增加阿法替尼在Caco-2细胞中的蓄积,并且降低阿法替尼在大鼠三明治细胞中的胆汁排泄指数。此外,双向转运实验表明,阿法替尼由基底侧向基顶侧的转运,mock-/MDR1-MDCK净流出率为2.3,且维拉帕米可显著降低阿法替尼在MDR1-MDCK细胞的外排,阿法替尼可呈剂量依赖性的激活P-gp ATPase酶活性,其Km为1.05μM,Vmax为59.88 nmol ATP/mg h P-gp/min,表明阿法替尼是P-gp的底物。然而阿法替尼在HEK293转染细胞和mock细胞的摄取没有明显的差异。结论:抑制P-gp的功能可增加阿法替尼的肠道吸收和降低阿法替尼的胆汁排泄。在临床用药时需注意P-gp抑制剂或者底物与阿法替尼合用时产生的药物相互作用。第三部分阿法替尼通过下调P-gp、诱导凋亡和自噬,增强阿霉素对A549T细胞抗增殖作用目的:揭示阿法替尼增强阿霉素抗肿瘤作用的分子药代动力学机制。方法:采用CCK-8、流式细胞术、real time RT-PCR、Western bloting、药物蓄积实验、Hoechst 33258染色和MDC染色考察阿法替尼对阿霉素抗肿瘤作用的影响及其分子药代动力学机制。结果:阿法替尼增强了阿霉素对A549T细胞的抑制增殖作用。阿法替尼增加了阿霉素在耐药细胞中的蓄积。阿法替尼可以以浓度依赖性和时间依赖性下调P-gp的m RNA和蛋白表达。阿法替尼通过抑制PI3K/Akt通路,下调P-gp蛋白表达。阿法替尼与阿霉素合用后,相关的凋亡指示蛋白cleaved caspase-3,PARP和自噬指示蛋白LC3B,Beclin表达增加,在耐药细胞中阿法替尼增强了阿霉素诱导的细胞凋亡和自噬。结论:阿法替尼通过抑制PI3K/Akt信号通路下调P-gp的表达。阿法替尼可以通过下调P-gp,增加阿霉素的胞内蓄积,并诱导阿霉素引起的细胞凋亡和自噬,增强阿霉素的抗肿瘤作用。