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研究目的:重金属污染所致健康危害已成为全球重点关注的公共卫生问题,其中污染严重且生物效应强的重金属主要是指铅（Lead,Pb）、汞（Mercury,Hg）和镉（Cadmium,Cd）,它们在低剂量下即可对机体尤其是神经系统产生持久影响。在实际生活和环境中,这些重金属往往不是单独存在,常共存于我们赖以生存的空气、水和土壤中,并通过多种途径进入人体。目前国内外一般人群血液中均能同时检测到Pb、Hg和Cd这三种重金属。然而,Pb、Hg和Cd混合暴露所致健康损害效应及其机制尚不清楚。为此,本研究通过建立低剂量Pb、Cd和Hg混合暴露大鼠模型,探讨低剂量重金属混合暴露对大鼠空间认知能力的影响及大鼠海马树突棘形态结构和AMPAR表达分布的可能机制,为阐明低剂量重金属混合暴露的神经毒性及其机制提供依据。研究方法:1、重金属染毒剂量及模式选择SH-SY5Y细胞进行浓度梯度Pb、Cd和Hg单独染毒,CCK-8试剂盒检测细胞活力后计算各重金属的未观察到有害作用水平（no observed adverse effect levels,NOAELs）。在NOAELs基础上,采用2×2×2析因实验设计探讨低剂量Pb、Cd和Hg暴露引起神经毒性的交互作用规律。通过比较不同剂量不同重金属组合的细胞毒性确定重金属染毒剂量及组合模式。2、重金属混合暴露动物模型建立:确定动物实验重金属染毒剂量及组合模式后,将性成熟SD大鼠按雌:雄=2:1比例配对进行合笼,受孕成功的大鼠随机分至空白对照组（饮蒸馏水）、1×MM组（饮用含有25.0mg/L的三水乙酸铅、7.5mg/L的氯化镉和0.15mg/L的氯化汞混合液染毒）、5×MM组（染毒剂量为1×MM组的5倍）及10×MM组（染毒剂量为1×MM组的10倍）,选择其雄性仔鼠作为研究对象,通过母乳染毒至断乳,即出生后23天（Postnatal day 23,PND23）,期间持续监测仔鼠体重变化。3、大鼠空间认知能力检测:通过Morris水迷宫试验检测大鼠空间认知及学习记忆能力,分别进行潜伏期和搜索策略分析。4、大鼠全血及脑组织重金属含量检测:利用电感耦合等离子体质谱仪（Inductively coupled plasma mass spectrometry,ICP-MS）检测大鼠全血及脑组织中Pb和Cd的含量,利用冷蒸汽原子荧光光谱法（Cold vapor atomic fluorescence spectrometry,CV-AFS）检测Hg的含量。5、大鼠海马神经元损伤检测:利用硫堇染色分析重金属混合暴露对大鼠海马各区域神经元密度影响。6、树突棘结构变化检测:利用Golgi-cox染色的方法观察重金属混合暴露对大鼠海马各区域树突棘密度及形态的影响。7、Glu R1蛋白表达及分布情况检测通过Western blot检测α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸受体（α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid receptor,AMPAR）的谷氨酸受体1（glutamate receptor 1,Glu R1）亚型的蛋白表达水平。利用免疫荧光结合激光共聚焦技术,通过MAP2和PSD-95分别标记神经元树突和突触后膜,检测Glu R1在神经元树突及突触后膜的定位情况,反映Glu R1的分布。研究结果1、重金属Pb、Cd和Hg染毒剂量及组合的确定CCK-8检测发现,Hg、Pb和Cd在72 h的单独暴露对SH-SY5Y细胞活力的NOAELs（No observed adverse effect levels）分别为1.0μmol/L（200.86μg/L）、0.5μmol/L（97.30μg/L）、0.1μmol/L（11.16μg/L）。在此基础上进行的析因设计实验显示,染毒48h及72h时,当单个金属均低于NOAELs时,仅Pb+Cd+Hg组细胞活力较对照组下降（P＜0.05）,并且Pb、Cd和Hg联合暴露对细胞活力具有交互作用（P＜0.05）。因此,本研究确定Pb+Cd+Hg混合暴露为染毒组合模式,以低于NOAELs且具有实际意义的一般人群血液负荷及其相关水平为染毒剂量进行后续的整体动物实验。2、大鼠全血及脑组织中Pb、Cd和Hg含量:通过ICP-MS和CV-AFS检测发现,1×MM组大鼠血液中这三种重金属的含量分别为:Pb 21.80±2.76μg/L、Cd 0.39±0.33μg/L、Hg 1.42±0.21μg/L,与中国一般人群血液负荷水平接近（Pb 34.90μg/L、Cd 0.49μg/L、Hg 1.81μg/L）,且Pb、Cd、Hg三种重金属在大鼠血液和脑组织中的含量均随饮水暴露浓度的增加呈剂量反应性增加（5×MM组含量为Pb 69.61±16.60μg/L、Cd 5.58±1.78μg/L、Hg2.95±0.48μg/L;10×MM组含量为Pb 93.58±19.22μg/L、Cd 6.37±2.31μg/L、Hg5.16±0.23μg/L）。3、Pb、Cd和Hg混合暴露对大鼠空间认知的影响:水迷宫检测发现,各组大鼠寻找隐匿平台的逃避潜伏期随暴露剂量的增加而延长,且5×MM组和10×MM组与空白对照组相比有统计学差异（P＜0.01）;此外,通过进一步的学习策略分析发现,各暴露组（1×MM组,5×MM组和10×MM组）相较于空白对照组更偏向与使用非认知的探索策略（P＜0.01）。4、Pb、Cd和Hg混合暴露对大鼠海马神经元的影响通过硫堇染色观察发现,重金属混合暴露导致大鼠海马CA1区各暴露组,CA3和DG区的5×MM组和10×MM组神经元密度下降（P＜0.01）。5、Pb、Cd和Hg混合暴露对大鼠树突棘形态的影响通过Golgi-cox染色发现,大鼠海马CA1和DG区各暴露组的树突棘密度均降低（P＜0.05）,CA3区的5×MM组和10×MM组树突棘密度降低（P＜0.05）。同时,Pb、Cd和Hg混合暴露导致大鼠树突棘类型改变。CA1区各暴露组蘑菇型树突棘比例下降,而CA3及DG区5×MM组和10×MM组蘑菇型树突棘比例下降（P＜0.05）。其余树突棘类型改变表现为暴露组细长型及丝状伪足型树突棘比例下降,粗短型树突棘比例上升（P＜0.05）。6、Pb、Cd和Hg混合暴露对大鼠Glu R1的表达及分布影响通过Western blot检测发现,暴露组Glu R1表达下降,其中5×MM组和10×MM组较空白对照组相比,差异有统计学意义（P＜0.05）。同时,通过免疫荧光检测发现,大鼠海马CA1、CA3及DG区Glu R1表达均出现下降。其中,CA1及CA3区的Glu R1表达在5×MM组和10×MM组表达较空白对照组下降（P＜0.05）,DG区的Glu R1表达在10×MM组较空白对照组下降（P＜0.05）通过MAP2与Glu R1免疫荧光双染发现,CA1区的MAP2表达在各暴露组均出现降低（P＜0.05）,而CA3及DG区的表达则在5×MM组和10×MM组出现下降（P＜0.05）。Pb、Cd和Hg混合暴露导致MAP2-Glu R1共定位点减少,其中CA1区各暴露组均较空白对照组减少（P＜0.05）,CA3及DG区的5×MM组和10×MM组MAP2-Glu R1共定位点较空白对照组减少（P＜0.05）。通过PSD-95与Glu R1免疫荧光双染发现,CA1区的PSD-95表达在各暴露组均出现降低（P＜0.05）,CA3及DG区的表达则在5×MM组和10×MM组出现下降（P＜0.05）。而PSD-95-Glu R1共定位点在CA1区表现为各暴露组均较空白对照组减少（P＜0.01）,在CA3及DG区表现为5×MM组和10×MM组较空白对照组减少（P＜0.05）。结论:1、当单个重金属均低于NOAELs时,Pb、Cd、Hg联合暴露可引起协同神经细胞毒性损伤;2、低剂量重金属Pb、Cd和Hg混合暴露可致大鼠空间认知能力损伤,并且具有浓度依赖性;3、Pb、Cd和Hg混合暴露所致大鼠空间认知损伤,可能与大鼠海马神经元树突棘形态结构以及海马神经元树突和突触后膜的AMPAR分布有关。