植物小孢子胚胎发生是单核靠边期的小孢子通过胁迫处理从原本的配子体发育途径转变为孢子体发育途径的过程,这个过程的命运抉择可能受到某些相关基因的调控。目前只有较少的相关研究通过转录组、代谢组等手段筛选出了多种物种小孢子胚胎发生早期某些特异表达的基因,但关于这些基因更进一步的功能分析和调控机制仍少有报道。已有研究表明NtDRP是烟草合子早期胚胎发育过程的重要基因,可以用来标记区分受精前的卵细胞和受精后的合子。实验室前期工作发现NtDRP在烟草小孢子的早期胚胎发生过程中可能也有重要作用,这为我们探索小孢子胚胎发生过程的调控机理和分子机制提供了很好的切入点,其中的关键是NtDRP的上游调控机制和下游信号通路。本实验以烟草为研究对象,分析了NtDRP的上游调控机制,同时对其下游互作蛋白也进行了初步的探索,主要研究结果如下:1、本实验在实验室前期研究工作的基础上,筛选了可能与NtDRP启动子结合的待验证转录因子35个,并完成了酵母单杂交载体构建。2、酵母单杂交初步筛选得到7个候选的转录因子,分属于ERF、b HLH、FIT、MADSBOX和CAULIFLOWER 5个基因家族。3、酵母单杂交进一步验证7个候选转录因子与11个启动子片段具体结合情况,结果显示7个转录因子优势结合在P1、P4、P5、P7、P10等5个启动子片段上,暗示这5个片段上可能有与转录因子结合的顺式作用元件。4、利用生物信息学方法预测了转录因子在启动子片段上的可能结合位点,再结合酵母单杂交实验结果进行综合分析,发现CACGTG序列,即G-BOX核心序列可能是转录因子结合在启动子上的顺式调控元件。5、荧光定量PCR分析7个候选转录因子和NtDRP在小孢子培养不同阶段的表达趋势,发现有5个转录因子和NtDRP有相似的表达趋势,即在小孢子的热激胁迫阶段只有极低的表达量甚至不表达,而在转营养培养3天和5天时表达量出现明显的上升。另外两个转录因子在不同培养阶段均未检测到明显的表达,故在后续实验中不再验证其与启动子结合和调控作用。与NtDRP表达模式相似的5个候选转录因子还需进一步验证与NtDRP启动子的结合和调控作用。6、酵母双杂交初步筛选了15个与NtDRP互作的蛋白,功能分析结果显示候选蛋白与光信号、细胞周期、细胞分裂、氧化胁迫、蛋白磷酸化等相关,暗示NtDRP可能通过多种下游调控通路影响小孢子胚胎发生。