目的:NK细胞是天然免疫系统的主要效应细胞，具有广泛的生物学功能，位于机体抵抗肿瘤和病毒感染的第一道防线；不需要预先刺激即可识别并杀伤肿瘤和病毒感染的细胞，同时又能通过早期分泌多种细胞因子(如IFN-γ、GM-CSF和TNF-β)和趋化因子来调节获得性免疫应答，因此，是连接天然免疫和获得性免疫的桥梁。 NK细胞表面存在激活性受体和抑制性受体。抑制性受体包括KIR(killercellIg-likereceptors)家族和NKG2A，NKG2A是凝集素家族NKG2系列的典型的抑制性受体的代表，在人类，其配体为HLA-E分子；激活性受体包括NKp44、NKp30、NKp46和NKG2D，NKG2D大概是目前与细胞应激反应(包括转化、感染和细胞压力等)相关的最具特征性的一种激活性受体。主要表达于活化的CD8+T细胞、NK细胞和γδT细胞等。在人类，其配体主要为MICA(MHCclassIchain-relatedA)，MICB(MHCclassIchain-relatedB)，ULBP(UL16-bindingprotein)-1，2，3，4。它的单独活化即足以刺激NK细胞的活化，并能克服抑制性受体的强势信号。 组蛋白乙酰化酶(Histoneacetyltransferases，HATs)和组蛋白去乙酰化酶(Histonedeacetylases，HDACs)在真核细胞基因的转录调控中发挥着重要的作用，能调节核内蛋白质的乙酰化水平与基因转录。近年来研究发现，HATs和HDACs的异常与肿瘤的发生有着密切的关系，应用组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACI)可以诱导肿瘤细胞分化和凋亡，抑制肿瘤增殖，因而HDACI被认为是新一代抗肿瘤药物。 在本研究中，我们一方面观察了13种肿瘤细胞系中NKG2D配体mRNA的表达情况，并分析其表达水平与NK细胞杀伤敏感性的相关性，以期探讨NKG2D配体在肿瘤细胞系中的表达及其意义。另一方面，我们研究了低剂量组蛋白去乙酰化酶抑制剂丙戊酸钠(VPA)和丁酸钠(SB)对肿瘤细胞(肝癌细胞HepG2和子宫颈癌细胞HeLa)的NKG2D配体MHCⅠ类链相关分子MICA、MICB表达的影响，以及组蛋白去乙酰化酶抑制剂对肿瘤细胞对NK杀伤敏感性的影响；继而研究VPA和SB对MHCⅠ类链相关分子影响的机制。 方法: (1)半定量RT-PCR法检测肿瘤细胞系中NKG2D配体的mRNA表达； (2)MTT法测定NK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性； (3)免疫组织化学技术和Westernblot法检测肿瘤细胞中MICA蛋白表达情况，FACS检测肿瘤细胞膜MICA、MICA/B和ULBP3表达情况； (4)半定量RT-PCR和FACS法检测VPA和SB对MICA和MICB表达的影响； (5)生物信息学分析MHCⅠ类链相关分子启动子序列中的转录因子结合位点； (6)RT-PCR法和Westernblot法分别检测VPA和SB对肿瘤细胞启动子转录因子基因和蛋白的影响； (7)染色质免疫共沉淀技术验证转录因子和启动子的结合； (8)萤光素酶报告基因技术检测VPA和SB对MICA启动子活性的影响。 结果: 1.13种肿瘤细胞系表达不同水平的NKG2D配体mRNA 其中Hep2细胞MICA表达强阳性，HeLa、HepG2、MDA231、HT29、SGC7901、M21、K562、Jurkat细胞MICA表达阳性，而Caski、PG、HL60和Raji细胞不表达MICAmRNA。 2.NKG2D配体的表达水平和NK细胞杀伤活性的相关性 13种肿瘤细胞系中MICAmRNA表达强度与NK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性高度相关，相关系数在效靶比为20:1、10:1、5:1时分别为0.908(P＜0.001)、0.945(P＜0.001)、0.851(P＜0.001)。MICBmRNA表达强度与NK细胞杀伤活性的相关系数在效靶比为20:1、10:1、5:1时分别为0.712(P=0.006)、0.790(P=0.001)、0.652(P=0.016)。ULBP3mRNA在效靶比为10:1时与NK细胞杀伤活性的相关系数为0.608(P=0.036)，其他ULBP成员的mRNA表达水平均与NK细胞杀伤活性无明显相关性(P＞0.05)。 3.丙戊酸钠和丁酸钠对HepG2和HeLa细胞增殖活性的影响 MTT实验表明，4mM及以下浓度丙戊酸钠和丁酸钠对两种肿瘤细胞系HeLa和HepG2的增殖有轻度抑制作用，并且呈剂量和时间依赖关系。 4.丙戊酸钠和丁酸钠增强HeLa和HepG2细胞MICA、MTCB分子表达 半定量RT-PCR检测丙戊酸钠和丁酸钠作用于HeLa和HepG2细胞后MICA、MICBmRNA水平的变化。发现丙戊酸钠和丁酸钠可增强HeLa和HepG2细胞MICA/BmRNA的表达，并呈一定的时间和剂量依赖关系。利用流式细胞技术检测发现，经4mM丙戊酸钠和丁酸钠分别预处理后，HeLa和HepG2细胞表面MICA/B分子表达均明显增强。 5.丙戊酸钠和丁酸钠增强肿瘤细胞对NK细胞杀伤的敏感性 丙戊酸钠和丁酸钠明显上调HeLa和HepG2细胞对NK杀伤的敏感性。且经抗MICA/B抗体封闭后，NK细胞对丙戊酸钠和丁酸钠诱导后Hela细胞的杀伤率明显降低，并呈抗体剂量依赖关系。 6.丙戊酸钠和丁酸钠对HeLa和HepG2细胞转录因子Spl、Hsfl及Hsp70表达的影响 半定量RT-PCR检测发现，HeLa和HepG2细胞经丙戊酸钠和丁酸钠作用后，Spl和Hsp70mRNA表达增加，而HsflmRNA却无明显变化。WesternBlot技术进一步证实，丙戊酸钠和丁酸钠增强HeLa和HepG2细胞Spl和Hsp70蛋白表达。 7.染色质免疫共沉淀实验检测转录因子Hsfl和Spl结合MICA及MICB启动子DNA情况 结果显示，丙戊酸钠和丁酸钠增加转录因子Hsfl和Spl与MICA及MICB启动子的结合。 8.丙戊酸钠和丁酸钠增强HeLa和HepG2细胞MICA启动子的活性 4mM丙戊酸钠和丁酸钠分别预处理HeLa和HepG2细胞48h后，可显著提高MICA启动子在两株细胞中的转录活性。 结论:本研究有以下创新性的发现： 1.在6种人NKG2D配体中，MICA的表达水平与肿瘤细胞对NK细胞杀伤的敏感性关系最为密切，肿瘤细胞MICA的表达水平可能决定着机体NK细胞抗肿瘤免疫应答的强弱。 2.丙戊酸钠和丁酸钠均能上调肿瘤细胞HepG2和HeLaMICA、MICBmRNA和蛋白的表达，继而增强NK对其的识别与杀伤。 3.丙戊酸钠和丁酸钠能够上调转录因子SPl和Hsp70的表达，增强Hsfl和Spl与MICA及MICB启动子的结合，增强MICA启动子的活性，进而促进MICA和MICB的表达表达。 本研究系统探讨了组蛋白去乙酰化酶抑制剂丙戊酸钠和丁酸钠对肿瘤细胞NKG2D配体表达的促进作用及其分子机制，为寻找肿瘤细胞NKG2D配体的调控因素，为促使活化性和抑制性信号的平衡向活化方向倾斜，增强机体抗肿瘤能力提供了新的思路，并为探讨抗肿瘤药物新的抗癌机制和指导肿瘤临床治疗提供了理论依据。