论文部分内容阅读
目的:肝癌是中国发病率和死亡率最高的癌症之一;适型照射以及质子和重离子在放射治疗中的应用使放射治疗在肝癌治疗中得到了很大的发展。研究影响肝癌细胞敏感性以及辐射损伤信号在肝癌细胞中的传导机理,降低辐照对正常肝组织的损伤,是扩展放疗在肝癌治疗应用的关键因素。连接蛋白26(Connexin26/Cx26)是构成间隙连接的蛋白,在肝脏中广泛表达。Cx26构成的间隙连接与辐射损伤信号在细胞间的传导密切相关。本研究以不同Cx26表达水平的肝癌细胞(HepG2、SK-hep1)为研究对象,通过不同剂量的X射线照射,检测肿瘤细胞的存活率以确定Cx26表达与肝癌细胞的放射敏感性之间的关系。相关质粒抑制、慢病毒过表达Cx26蛋白,并利用Western Blot技术,确定Cx26与辐射诱导的MAPK信号传导途径和下游NF-κB信号传导途径之间的关系,探讨Cx26在肝癌细胞放射敏感性中的作用及其分子机理。方法:在该研究中,使用具有低表达Cx26的HepG2肝癌细胞和具有高表达Cx26的SK-Hep1肝癌细胞,并分别通过CRISPR/Cas9质粒将Cx26基因表达敲除或者利用含有Cx26质粒的慢病毒诱导Cx26表达,构建了Cx26表达水平敲除或增加的细胞系(即HepG2 N-、SK-Hep-1N-、HepG2 A+、SK-Hep-1A+)。利用0,1,2,3,5Gy等不同剂量的X射线辐照6种肝癌细胞系,通过克隆形成实验检测辐照后6h肿瘤细胞的存活率;通过微核形成实验检测辐照后6h肿瘤细胞的微核形成率,确定Cx26表达量对于肝癌细胞辐射敏感性的影响;采用Western Blot方法检测6种受照射细胞系中Cx26、p-ERK/ERK、p-p38/p38和NF-κB蛋白的表达变化。结果:HepG2、SK-hep1两种肝癌细胞经过不同剂量的X射线辐照,Western Blot实验显示,HepG2细胞的Cx26表达水平比SK-hep1细胞的Cx26表达水平显著降低,且两种细胞的Cx26表达水平并没有受到照射剂量的影响;两种细胞中的p-ERK/ERK、p-p38/p38和NF-κB蛋白表达水平随着X射线辐照剂量的增加均呈增加趋势,且Cx26高表达水平的SK-hep1细胞中的p-ERK/ERK、p-p38/p38和NF-κB蛋白表达水平要高于Cx26低表达水平的HepG2细胞,在X射线辐照剂量为3Gy和5Gy时差异显著;为验证Cx26表达水平对MAPK信号通路的影响,我们使用CRISPR/Cas9质粒将HepG2和SK-hep1细胞中Cx26基因表达水平敲除,获得了相应低表达Cx26的HepG2 N-和SK-Hep-1N-细胞系。利用X射线辐照后,Western Blot实验显示,Cx26表达正常与敲除的HepG2和SK-hep1细胞中,p-ERK/ERK、p-p38/p38和NF-κB蛋白表达水平随着X射线辐照剂量的增加均呈增加趋势,但Cx26表达敲除的HepG2 N-、SK-Hep-1N-的细胞中,p-ERK/ERK、p-p38/p38和NF-κB蛋白表达水平显著降低,而Cx26诱导表达的HepG2 A+和SK-Hep-1A+细胞中的的p-ERK/ERK、p-p38/p38和NF-κB蛋白表达水平显著升高。克隆形成实验结果显示,sk-hep1A+细胞的D0值(D0(sk-hep1A+)=2.3878)较其他几种细胞D0值低(D0sk-hep1</sub>=2.85814 D0hepg2</sub>=3.35501 D0sk-hep1N-</sub>=3.34465 D0hepg2N-</sub>=3.66632 D0(hepg2A+)=2.77888)。CB法微核检测结果表明,HepG2 N-、SK-Hep-1N-的微核形成率明显低于其他细胞。结论:照射后,HepG2细胞比SK-hep1细胞存活率更高,微核形成更少(p<0.01)。辐射后,HepG2细胞中p38和ERK1/2的磷酸化水平低于SK-hep1细胞(p<0.01)。并且在辐射后,HepG2细胞中NF-κB的表达低于SK-hep1细胞(p<0.01)。Cx26敲除和上调细胞系中所得到的结果也证明,Cx26表达高的细胞显示出较高的放射敏感性。我们推测,Cx26的表达水平可能影响p38和ERK1/2的磷酸化以及下游NF-κB的表达,从而调节了肝癌细胞的放射敏感性。