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IL-16(interleukin-16,IL-16)最初是在1982年由Cruik Shank实验室从抗原刺激的单核细胞中分离提纯的[1],因具有T细胞特异性的趋化作用而被称为淋巴细胞趋化因子(Lymphocyte chromataxis factor, LCF)。前体由631个氨基酸构成,无生物学活性,被白介素-1β-转化酶( interleukin-1β- converting enzyme , ICE)在Asp510和Ser511位酶切后 [2],形成121个氨基酸大小的C端分泌性IL-16 (secreted interleukin-16, sIL-16), 它以非共价方式结合为四聚体结构, 并具有了生物学活性。sIL-16对于维持、促进细胞的生长、分化以及细胞的凋亡有密切关系,而且广泛参与体内免疫调节,同时有拮抗免疫缺陷病毒的作用。开始人们研究的热点集中于sIL-16如何抑制人类和动物获得性免疫缺陷病毒在CD4+T细胞的复制从而达到阻滞HIV感染,以后研究发现该因子除对CD4+T细胞具趋化作用外,对CD4+的单核细胞及嗜酸性粒细胞也有趋化作用,并能诱导人静止T淋巴细胞表达IL-2R及上调MHCⅡ类分子,参与哮喘发病极早期的调节,调节时段早于IL-4、IL-5等其它细胞因子,在哮喘发生过程中起重要作用。 用PCR法扩增本室保存的sIL-16 cDNA片段,选择NdeI和XhoI两个酶切位点定向插入含T7启动子同时带有6个组氨酸序列表达标签的载体pET28a(+)中构建重组质粒pET-sIL16, 得到阳性克隆后转化大肠杆菌BL21(DE3), 筛选表达菌株。观察不同温度下菌株经IPTG诱导表达产物可溶情况,选择最适宜温度进行表达。表达产物超声碎菌,离心后上清过Ni2+鏊和层析柱,根据咪唑梯度变化进行表达产物的纯化。表达产物与淋巴细胞共同孵育一段时间,通过流式细胞仪观察它对细胞表面某些分子表<WP=8>达的影响和它对细胞生长的刺激作用。 结果:(1)以sIL-16 cDNA为模板进行PCR反应扩增后,得到391bp大小的片段。(2)PCR产物与pET28a(+)连接,转化BL21(DE3),任选一个阳性菌落测序。所测序列结果与基因库所报告序列完全一致。(3)20℃经 IPTG诱导12h后,聚丙烯酰胺凝胶电泳显示在18kD处出现明显的蛋白条带,诱导前此条带不存在。蛋白印迹也显示在18kD处出现明显的蛋白条带。超声碎菌离心后,发现所表达蛋白部分位于上清中,电泳扫描显示占上清菌体蛋白40% 左右。充分离心后取上清过Ni2+鏊和层析柱进行纯化,纯化产物为单一的大约18kD大小的蛋白分子,即rIL-16。(4)通过不同浓度rIL-16对Jurkat 细胞的刺激,滴定rIL-16的最适浓度是1×10-9M。共孵育rIL-16与PBMC,FACS检测结果显示:与 rIL-16共孵育的PBMC表面IL-2R的表达水平比未经rIL-16处理的细胞增高了18.54%。 结论:从培养的淋巴细胞提取IL-16 RNA, 经逆转录成cDNA后,利用高效表达载体pET28a(+)在sIL-16的N端添加了6个组氨酸的标签,同时受控于T7启动子的调控下, 使蛋白得以高效表达并方便纯化。进行低温诱导减弱蛋白分子表面疏水基的相互作用, 有利于蛋白正确折叠形成可溶性天然的空间结构。与 rIL-16共孵育的PBMC表面IL-2R的表达水平比未经rIL-16处理的细胞增高了18.54%,说明rIL-16的刺激活化了PBMC。这样,首次使用原核表达载体pET28a(+)在大肠杆菌中高效表达具生物学活性的rIL-16, 为进一步结构与功能的研究奠定了良好基础。