对于胰岛细胞功能受损的糖尿病（1型及部分2型）患者来说,植入胰岛β细胞或其替代物是一个很理想的治疗手段。近年来,经门静脉胰岛细胞移植技术在临床上已有开展。但细胞来源不足及严重的免疫排斥反应等困难却极大的限制了这种疗法的广泛应用。利用人工的、非β细胞来源的β细胞进行基因或细胞治疗来治疗糖尿病受到广泛关注。干细胞作为一类具有极强自我更新及多向分化潜能的细胞,已经逐渐成为人们寻找胰岛β细胞替代物的新资源。来源于骨髓的细胞可在体外进行培养和扩增,并保持其向多种间充质细胞分化的潜能。如果骨髓基质细胞能够形成β细胞,因其可由人骨髓提供充足的细胞,其就可以成为糖尿病患者β细胞替代治疗的有用的靶细胞。另外,BMSCs通过直接基因转染,可从基因上调控这些细胞,而进一步增强这些细胞的分化潜能。所以,分化基因的转染技术是组织工程方案中利用这些细胞的关键。PDX-1作为胰腺发育过程中重要的转录因子指导胰腺的正常发育。PDX-1可以调节影响胰岛β细胞特性和功能的基因的表达,这些基因包括:insulin、GLUT-2、GK及淀粉样多肽等。一些研究已经明确显示,PDX-1做为一种程序重排因子,使非β细胞向β细胞分化,可以用于糖尿病的细胞/基因治疗。研究发现,GLP-1在体内外与PDX-1功能活化相偶联,刺激胰岛细胞的胰岛素分泌及增殖。在正常β细胞中,葡萄糖通过激活PDX-1的功能刺激胰岛素产生和分泌。体外高浓度葡萄糖是促进WB-1细胞进一步分化为有功能的胰岛素分泌细胞的关键。有人在MIN-6细胞系中证明,高浓度葡萄糖较低浓度葡萄糖更能提高PDX-1的转录活性。现已研究明确在胰腺β细胞中GLP-1、葡萄糖及胰岛素等调节PDX-1基因启动子。当PDX-1启动子被高浓度葡萄糖及GLP-1联合刺激,PDX-1的转录活性进一步提高,表明GLP-1和葡萄糖对PDX-1启动子的激活有叠加效应,说明GLP-1和葡萄糖可能通过不同的信号机制调节PDX-1的转录。GLP-1和葡萄糖对胰腺分化的作用一直通过AR42J、RIP、Panc-1、IMPE、Capan-1、MIN6及WB-1等细胞系进行,主要是GLP-1和葡萄糖对PDX-1表达的调控进行研究。GLP-1和葡萄糖联合转染PDX-1对骨髓干细胞的作用尚不清楚。所以,本文对GLP-1和葡萄糖联合转染PDX-1基因调控骨髓干细胞的分化及胰岛素分泌的作用进行研究,为将骨髓干细胞有效地诱导分化为胰岛素分泌细胞提供实验基础。本研究分为以下三部分:第1部分pEGFP-PDX-1真核表达载体的构建目的:构建真核表达质粒,从基因水平着手研究胰腺内分泌细胞发育的关键基因PDX-1在骨髓源干细胞定向分化中的作用。方法:1.pEGFP-C2-PDX-1真核表达系统的构建实验参照分子克隆技术方案进行1.1以质粒SK900BLSCRIPT为模板,PCR扩增目的片断PDX-1,选SK900BLSCRIPT质粒中PDX-1基因两端设计引物,并在引物中5’端引入HindⅢ位点,设计并合成引物为:正向引物:5’-CGC AAG CTT CATG AAT AGT GAG GAG CAG T-3’反向引物:5’-GCG CGA TCC C TCA CCG GGG TTC CT-3’1.2 PCR扩增目的片断PDX-1,将PDX-1 cDNA插入pEGFP-C2的多克隆位点中,构建一个重组表达质粒pEGFP-C2-PDX-1。1.3对重组质粒进行酶切和测序。2.质粒DNA的抽提和纯化所有DNA质粒用EndoFree Plsmid Kit（Tiangen）,参照说明书步骤进行提取和纯化。紫外分光光度计UV2201（日本岛津）测OD260nm,280nm吸光值,测定质粒的量及纯度。结果:1.限制性酶切分析证实重组后的载体成功载入PDX-1基因克隆的目的片断。2.经序列测定目的基因与EGFP具有共同的启动子,与EGFP形成融合表达。3.OD260吸光度值为0.086,OD280为0.046,其比值为1.874,证明质粒纯。质粒总量为390μg。结论:构建了真核表达载体pEGFP-C2-PDX-1,经酶切及序列分析证实,目的基因插入位点和读码框正确,无突变,与EGFP为融合表达,载体构建成功。第2部分Nucleofector^TM转染仪转染PDX-1至骨髓基质细胞的优化及表达目的:运用amaxa Biosystems公司的开发的Nucleofector^TM转染仪,优化转染方案,提供一种体外高效转染大鼠骨髓细胞的方法。方法:1.细胞的分离和培养1.1 MSCs的分离和培养取3-4周龄SD大鼠,取胫骨和股骨骨髓细胞,密度梯度离心法获得骨髓单个核细胞,接种于含10%FBS的L-DMEM中（37℃,5%CO2）;一周后细胞长至70-80%融合时,消化传代。1.2 NSCs的分离和培养取3-4周龄大鼠,取胫骨和股骨骨髓细胞,全骨髓细胞冲吸制成单细胞悬液,接种于含10%FBS的神经干细胞培养基中（37℃,5%CO2）,原代培养7-10天。2.细胞生物学特性的鉴定2.1倒置相差显微镜下观察两种细胞的形态。2.2RT-PCR检测细胞nestin基因的mRNA。2.3免疫细胞化学检测细胞nestin蛋白。3.细胞转染方案按Nucleofector^TM说明书步骤进行操作。3.1启用A31/A33程序,pEGFP-C2质粒5μg转染MSCs和nestin⁺细胞,转染后接种于含10%FBS的L-DMEM,24h后观察细胞,荧光显微镜下计数转染率。3.2启用A33程序,质粒pEGFP-C2 5μg转染Nestin⁺细胞,转染后分别接种于含10%FBS和20%FBS的L-DMEM培养中。3.3启用A33程序,分别以5μg、15μg及30μg重组质粒pEGFP-PDX-1转染Nestin⁺细胞,转染后接种于含20%FBS的L-DMEM中。4.荧光显微镜下计数转染率。5.胎盼蓝拒染实验计数细胞存活率。6.流式细胞仪计数转染率。7.RT-PCR检测PDX-1的mRNA。8.免疫荧光检测转染细胞的PDX-1蛋白。9.Westernblot检测转染细胞的PDX-1蛋白。10.统计学分析使用独立样本t检验,P＜0.05为有统计学意义。结果:1.MSC s的分离和培养密度梯度离心法获得的单个核细胞,胎盼兰染色99%有活性,接种于25cm²的培养瓶中,以2-3x10⁶/cm²接种,约1周达70-80%融合,胰酶传代:传至第3-4代,细胞形态基本一致,与成纤维细胞形态相似,大部分呈长梭形,排列规则,呈水草样状。2.NSCs的分离和培养全骨髓细胞从成鼠股骨中分离获得接种后48-72h后细胞半贴附于皿底,仍呈圆形,并出现细胞分裂现象。这时细胞增殖能力明显增强,细胞迅速增多,并可见少量的细胞球和形态相对均一的大圆细胞。1w细胞增大变圆,分裂细胞逐渐增多,并形成岛屿状细胞克隆或形成球,主要是大圆细胞,背底为一些形态各异的杂细胞,90%融合。培养8-10d后,出现星形细胞。3.RT-PCR检测P4 MSCs nestin的mRNA阴性:培养6d的NSCs nestin的mRNA阳性。4.P4MSCs免疫细胞化学检测nestin阴性;培养6d的NSCs免疫细胞化学检测nestin阳性。5.转染方案5.1转染24h荧光显微镜下计数各组转染率。各组间比较用t检验（One-wayANOVA）,采用LSD法进行分析（F=90.93,P=0.000）。程序A33（30.56±3.29/3.62±0.95,P＜0.05）和A31（15.1±5.07/2.22±0.64,P＜0.05）转染nestin⁺细胞均较转染MSCs获得更高转染率,差异有统计学意义。转染nestin⁺细胞,A33较A31具有更高的转染率（30.56±3.29/15.1±5.07）,差异有统计学意义。5.2两种浓度血清培养转染后细胞的转染率及存活率数据分析采用独立样本t检验（转染率:F=0.226,P=0.647;存活率:F=0.589,P=0.465）。取5μg质粒用A-33程序转染,转染后分别接种于含10%、20%FBS的L-DMEM中,接种于20%FBS的细胞24h转染率显著高于10%FBS组（38.98±4.0/30.56±3.29,P＜0.05）;48h细胞存活率,含20%FBS高于含10%FBS培养基组（89.18±4.25%/67.04±3.60%,P＜0.05）,差异有显著意义。5.3.流式细胞仪检测优化方案后的转染率,启用A33程序,转染nestin⁺细胞,分别以5μg、15μg及30μg pEGFP-PDX-1质粒转染,转染后培养基为含20%胎牛血清的L-DMEM,测得的转染率分别为33%,45.4%及78.6%。6.RT-PCR检测转染后骨髓NSCs有PDX-1的mRNA表达。7.免疫荧光检测转染后nestin⁺细胞的PDX-1表达为阳性。8.Western blot.分析在转染了重组质粒的nestin⁺细胞中可检测到一46k Da的条带,而未转染的细胞未检测到。结论:相同条件下转染nestin⁺细胞较转染MSCs可获得更高的转染效率;提高转染后培养基的血清浓度可提高转染后细胞转染率及存活率;质粒30μg获得最佳的转染效率。通过RT-PCR、免疫荧光及Western blot检测可检测到PDX-1基因及蛋白水平的表达。骨髓源nestin⁺细胞可做为组织工程的种子细胞用于糖尿病的细胞治疗。第3部分PDX-1基因、GLP-1及GLU对Nestin⁺细胞分化IPCs的影响目的:在培养nestin⁺细胞并转染PDX-1基因的基础上,用GLU、GLP-1以及GLU+GLP-1诱导其向IPCs分化,探讨PDX-1基因、GLP-1及GLU对骨髓源nestin⁺细胞分化为IPCs的功能、作用及相互关系。方法:1.实验分组:A组:转染PDX-1基因的nestin⁺细胞接种于未加细胞因子的L-DMEM;B组:转染PDX-1基因的nestin⁺细胞接种于加入GLP-1（100nM）的L-DMEM;C组:转染PDX-1基因的nestin⁺细胞接种于加入GLU（25mM）的L-DMEM;D组:转染PDX-1基因的nestin⁺细胞接种于加入GLP-1（100nM）+GLU（25mM）的L-DMEM;E组:未转染PDX-1的nestin⁺细胞接种于加入GLP-1（100nM）+GLU（25mM）的L-DMEM。2.相差显微镜下观察细胞形态的变化。3.在诱导第7d运用RT-PCR检测Isll、PDX-1的mRNA表达。4.免疫荧光和Westemblot检测PDX.1的表达,每次实验均设阴性对照、阳性对照和空白对照。5.免疫细胞化学和免疫荧光进行Insulin蛋白表达的鉴定,每次实验均设阴性对照,阳性对照和空白对照。6.ELISA检测培养液中GLU负荷前后的胰岛素、C肽的分泌情况,以含0.5%BSA无血清培养基做为对照液。7.所有计量资料以（?）±s表示,两组比较用t检验（One-way ANOVA）,P＜0.05表示差异有显著性意义。结果:1.实验组A、E组细胞分裂增生能力活跃,核浆比增加,但未聚集成团;B,C,D组细胞分裂增生能力强,核将比增加,在诱导后6-7d聚集成团。2.RT-PCR检测Isll、PDX-1的mRNA实验组A组可检测到PDX-1的mRNA;B、C、D组Isll、PDX-1基因表达均阳性;E组两组基因检测均为阴性。3.免疫荧光和Western blot检测PDX-1的表达免疫荧光检测A、B、C、D各组PDX-1表达均为阳性;E组PDX-1表达均为阴性;Western blot检测结果和免疫荧光的结果一致。4.免疫细胞化学和免疫荧光进行Insulin蛋白表达的鉴定免疫细胞化学结果:A组Insulin阴性;B、C、D组Insulin阳性;E组Insulin阴性;免疫荧光检测结果和免疫细胞化学结果一致。5.ELISA检测A、B、C、D组培养液中GLU负荷前后的胰岛素、C肽的分泌情况,各组间比较用t检验（One-way ANOVA）,采用LSD法进行分析。葡萄糖刺激前胰岛素（pg/ml）/C肽（ng/ml）的水平（C肽:F=69.56,P=0.000;胰岛素:F=48.09,P=0.000）。:A组:141.99±27.46/0.08±0.02;B组:331.504±38.96/0.35±0.01;C组:340.25±46.42/0.334±0.06;D组:346.50±27.96/0.334±0.04;对照液:121.93±14.74/0.05±0.03。C肽:A组与对照液比较,差异无显著意义;A组与B、C、D组比较差异有显著意义（P=0.000）;B、C、D组与对照液比较差异有显著意义;B、C、D组间比较差异无显著意义（P＞0.05）:胰岛素:A组与对照液比较,差异无显著意义;A组与B、C、D组比较差异有显著意义（P=0.000）;B、C、D组与对照液比较差异有显著意义;B、C、D组间比较差异无显著意义（P＞0.05）。葡萄糖刺激后胰岛素（pg/ml）/C肽（ng/ml）的水平（C肽:F=35.19,P=0.000;胰岛素:F=24.20,P=0.000）。A组:152.00±30.17/0.06±0.01;B组:332.00±44.02/0.37±0.02;C组:337.75±81.81/0.37±0.09;D组:377.75±44.51/0.40±0.09。对照液:116.50±17.74/0.06±0.03。C肽:A组与对照液比较,差异无显著意义;A组与B、C、D组比较差异有显著意义（P=0.000）;B、C、D组与对照液比较差异有显著意义:B、C、D组间比较差异无显著意义（P＞0.05）;胰岛素:A组与对照组比较,差异无显著意义;A组与B、C、D组比较差异有显著意义（P=0.000）;B、C、D组与对照组比较差异有显著意义;B、C、D组间比较差异无显著意义（P＞0.05）。结论:1.单独转染PDX-1不能使骨髓来源的nestin⁺细胞分化为IPCs:2.细胞因子GLP-1与GLU单独/联合均不能使nestin⁺细胞分化为IPCs;3.在细胞因子GLP-1或/和GLU的作用下可使转染了PDX-1的nestin⁺细胞可分化为IPCs;4.GLP-1与GLU均可使nestin⁺细胞分化来的IPCs在静息状态下及GLU刺激下分泌胰岛素,但二者联合不能够使细胞分泌胰岛素的功能进一步提高。