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背景:膀胱的先天结构不良或病理性缺损等引起的膀胱储尿排尿功能障碍,严重影响患者生活质量,往往需要膀胱重建手术来恢复其功能。临床上膀胱重建主要利用自体的一段肠道来进行膀胱扩大或原位替代,但是创伤大,手术复杂,并发症多。也有采用脱细胞基质和人工合成材料进行实验性的膀胱重建术,但远期效果较差。理想的人造膀胱不仅需要在上皮层重建前保护组织免受尿液的腐蚀,还应具备结构完整的肌肉层,从而起到支持和收缩的作用,以促进正常排尿功能恢复。而目前泌尿组织工程学在膀胱肌层再生方面的研究还不充足和深入。静电纺丝技术制备的纤维膜有纳米级微孔,小分子营养可以自由扩散且宏观上是致密的膜可以有效减少液体渗漏,但二维的表面不能容纳足够的细胞,三维打印技术可以构建三维的结构从而容纳更多的细胞,从而促进有厚度的肌层再生,脂肪源干细胞(ADSCs)有良好免疫调节的能力且在诱导因子作用下有成肌分化的能力,是膀胱组织工程的良好细胞来源。目的:通过制备有着三维结构和差异孔隙的网格-电纺膜双层支架,探究该支架在细胞迁徙和生长中是否提供支持和保护,电纺膜层是否可持续释放肝素并诱导ADSCs向功能平滑肌细胞分化,并探讨由该双层支架和ADSCs构成的补片修复大鼠膀胱缺损的可行性以及促进膀胱功能重建的能力。方法:(1)为了得到三维差异孔隙的双层支架(PB-HCS/PCL),首先借助压电式3D打印,制备大孔隙的网格结构支架。然后以含有膀胱脱细胞基质(BAM)的聚己内酯(PCL)混合溶液为壳外相,肝素溶液为内相,通过同轴电纺的技术在3D打印支架表面制备一层壳核电纺纤维膜,利用扫描电镜观察双层支架的层次和孔隙差异。通过透射电镜观察静电纺丝纤维内部的壳核结构,为了评估壳核电纺膜的缓释能力,同时制备三种不同的电纺纤维膜:PCL/BAM/肝素直接混合(PBH-Mix)、PCL-肝素壳核支架(P-HCS)、PCL-肝素壳核支架(PB-HCS),用甲苯胺蓝法测定PBH-Mix、P-HCS、PB-HCS体外肝素的释放水平。(2)从大鼠腹股沟区提取ADSCs,应用流式细胞仪进行鉴定。用CCK8法检测种植于不同支架材料上细胞的增殖水平。然后将ADSCs种植于空白孔中分别用无诱导培养基、单纯平滑肌诱导培养基(SMIM)培养,以及种植在PB-HCS/PCL双层支架上并于SMIM中培养2周,再通过细胞骨架染色观察细胞的迁徙以及形态变化,应用实时定量逆转录聚合酶链式反应(real time RT-PCR)检测平滑肌细胞诱导分化的ADSCs(即AD-iSMCs)中与肌性分化相关的基因表达情况。(3)18只切除部分膀胱壁的大鼠随机分成3组,用不同方式对大鼠进行膀胱缺损修补术,包括直接缝合组(n=6)、BAM直接修复组(n=6)、载AD-iSMCs的PB-HCS/PCL(AICSP)双层支架修补组(n=6),此外有4只未行手术的同批大鼠作为正常对照。术后1个月进行膀胱造影,大鼠处死后获取膀胱组织进行病理学检查,观察平滑肌和胶原等组织增生情况。结果:(1)制备的PB-HCS/PCL双层支架是一层为膜状一层为大孔径网格的双层结构。其中,电纺膜层由壳核结构的电纺纤维组成并具有纳米级微孔。肝素体外释放实验显示,PB-HCS 4周内肝素呈持续性释放,且浓度稳定在约20μg/mL。(2)大鼠脂肪源干细胞在流式细胞仪检测中,具有间叶干细胞表型。细胞骨架染色结果表明,ADSCs沿支架内壁生长,并逐渐相互融合成整片结构。RT-PCR的结果显示,PB-HCS/PCL双层支架联合诱导培养基能提高ADSCs中肌性分化基因的表达,ADSCs分化成为更利于膀胱功能修复的收缩型平滑肌细胞,且胶原水平接近正常。(3)体内试验中,大鼠缺损膀胱修复术1个月后,尿道逆行膀胱造影显示各组均无明显尿漏。直接缝合组膀胱容量明显小于正常;BAM直接修复组和AICSP双层支架修补组膀胱造影的膀胱容量不同程度地恢复,但BAM有过度扩张的表现;而AICSP双层支架修补组的修复后膀胱容量更接近正常组。组织学染色表明,膀胱上皮层和肌肉层均有一定再生,相比其他各修复组,双层支架组的肌束排列更规则,有明显的新生血管,而BAM直接修复组则显现为大量的胶原堆积,再生肌层形态不规则且量少。结论:(1)PB-HCS/PCL双层支架中的大孔隙的网格结构层有利于细胞沿支架内壁向深处生长,其中的电纺纤维层可持续地释放肝素,有助于脂肪源干细胞分化成接近收缩型平滑肌细胞的基因表型,并分泌类似正常组织的细胞外基质成分。(2)AICSP双层支架能够有效修复膀胱缺损,重建1个月后膀胱容量基本正常,同时观察到膀胱上皮层和肌肉层的再生。