背景原发性肝癌是全球最常见的癌症,乙型肝炎病毒是其主要的病因。一项基于亚太与北美的研究提示,慢性HBV感染发生原发性肝细胞癌的机会是普通人群的25-37倍。但乙型肝炎患者高发肝癌的确切机制并不清楚。近年来新的研究证实微环境在肿瘤发生发展中起着重要作用,尤其是微环境中细胞免疫对肿瘤的发生起着更为关键的作用。Prendergast GC等人提出“癌症是一种微环境和免疫疾病”这一重要概念。针对这一概念,有关学者也进行了大量探讨,研究主要集中在Th1细胞与Th2细胞失衡、NK细胞、Treg淋巴细胞、Th17细胞、巨噬细胞等。但评价肝细胞癌患者细胞免疫的整体状况研究相对少见。T细胞受体互补决定区3谱型分析技术是一项很好的反映机体细胞免疫功能的新方法。本研究采用该技术分析乙型肝炎病毒相关性肝细胞癌患者的局部与整体细胞免疫功能情况,并探讨局部细胞免疫在肝细胞癌发病机制中的作用。目的采用T细胞受体谱型分析技术对乙肝相关性肝细胞癌患者外周血、非肿瘤组织与肿癌组织中T淋巴细胞的TCR CDR3谱型特征进行分析,探讨肝细胞癌患者整体细胞免疫与肝癌局部细胞免疫之间的差异,从而了解局部细胞免疫在肝细胞癌发病机制中的作用,为肝细胞癌免疫治疗提供新的理论依据和客观的评价方法。方法(1)收录新乡市中心医院2015年3月-8月手术切除的乙肝相关肝细胞癌患者10例,术前收集肝素化的外周血10-20ml。并于术后收集配对的非肿瘤肝组织与肿瘤组织.⑵RNA提取、c DNA合成以及PCR扩增:使用总RNA提取试剂盒提取外周血、非肿瘤肝组织以及肿瘤组织总RNA,并经逆转录酶合成c DNA。根据文献设计合成TCRBV 24个家族上游引物,并在B链恒定基因区(BC)设计一条共用的FAM标记下游引物。采用RT-PCR扩增TCR各BV家族CDR3区基因,扩增产物进行1.5%的琼脂糖凝胶电泳分析,了解各BV家族的表达情况;(3)免疫扫描技术分析TCR BV家族谱系特点:取出6ul PCR扩增产物在6%聚丙烯酰胺凝胶电泳2h,在373 DNA序列分析仪(ABI公司)中电泳,通过Peak Scanner Software v1.0进行数据分析,并使用扭曲率、缺失率、正态分布率、单峰率以及复合评分来分析TCR-CDR3谱系的完整性与多样性。(4)TCRβ链CDR3序列测定:对经免疫扫描分析证明有单克隆增生的TCRBV家族,用上述PCR反应条件重新进行扩增,并对PCR产物直接测序。(5)统计学分析:用SPSS21软件进行统计学处理,各组间数据比较采用独立样本t检验,P<0.05有统计学意义。结果(1)乙型肝炎病毒相关肝细胞癌患者外周血、非肿瘤组织与肿瘤组织TCR BV各家族RT-PCR结果。扩增后的PCR产物经gelred染色,1.5%琼脂糖凝胶电泳初步分析,结果提示各例病人的TCR24个BV家族,大部分家族均有表达,少数BV家族呈现弱表达或不表达。(2)在10例HBV-RHCC患者外周血、非肿瘤肝组织与肿瘤组织TCR-CDR3 24个BV家族谱型图上,多数家族呈现扭曲分布,表现为单克隆、寡克隆峰以及偏态峰,发生不同程度的谱型偏移;部分家族呈现大于8峰的正态分布峰或类正态分布峰;小部分家族表达频率极低或缺失表现为无峰图。(3)鉴于不同患者以及不同家族在一定程度上呈现不同的CDR3谱系,使用扭曲率、缺失率、正态率、单峰率以及复合评分来进一步全面分析CDR3谱系的完整性与多样性。尽管在非肿瘤肝组织与肿瘤组织中未发现关于扭曲率、缺失率、正态分布率等方面的显著性差异,但是在两组中仍然能够发现其中的分布差异。此外,外周血T淋巴细胞比非肿瘤肝组织有更高的正态分布率(P=0.041),而在其他指标未见显著性差异。而相对于肿瘤组织而言,外周血T淋巴细胞拥有更加多样性的谱系(复合评分P=0.042)。(4)CDR3谱系与肝癌家族病史、乙型肝炎病毒水平以及AFP水平之间关联。当分析肝癌家族史与CDR3谱系之间的关系时,我们发现在PBLs中肝癌家族史组患者CDR3谱系复合评分显著高于非肝癌家族史组(P=0.016);而两组间其他方面数据未见显著差异(P>0.05)。此外,我们比较不同水平的AFP、乙肝病毒定量与CDR3谱系的关系,但均未见显著的统计学意义。(3)分析BV家族优势利用时,我们发现TCR-BV1(80%),-BV3(43.3%),-BV7(53.3%),-BV14(53.3),与-BV21(56.7%)家族显著高表达于HBV-RHCC患者的外周血、非肿瘤肝组织与肿瘤组织中。为了进一步分析优势利用,我们对免疫扫描证实为单克隆增生的家族进行TCRβ链CDR3序列测定,通过对比不同病例与不同组织的氨基酸序列时,发现了一些规律:(1)在不同的BV家族中未发现共有序列。(2)所有的共有序列均在相同的BV家族中发现,(3)在相同的组织中发现了共有序列,(4)在不同的组织与不同的样本中共有相关的序列。结论本研究使用免疫扫描技术对10例乙肝相关性肝细胞癌患者的外周血、非肿瘤组织以及肝癌组织中的T淋巴细胞受体24可变区家族互补决定区3长度分布进行分析。发现了外周血、非肿瘤组织以及肿瘤组织中显著差异的细胞免疫功能状态,并证实了在非肿瘤组织与肿瘤组织中存在着克隆性增殖。共有序列的发现为乙肝相关性肝细胞癌的靶向治疗提供了理论基础与潜在的靶点。