椎间盘退变是慢性下腰痛及脊柱功能损害的重要原因。由椎间盘退变可引起如椎间盘突出症、椎管狭窄症、脊柱滑脱症等一系列严重的临床疾患,90%以上的脊柱手术与椎间盘退变有关。椎间盘退变的病因学十分复杂,危险因素颇多,我们对它的研究也在逐步的深入。有许多实验方法和实验模型被应用于研究椎间盘的功能,这些实验模型包括在体动物模型及细胞离体培养模型等。在动物模型中,椎间盘退变通常由力学或化学方法诱导,但它不利于探究与细胞及基质代谢有关的疾病和信号传导方面的问题；许多研究者利用体外细胞培养进行研究,但失去细胞基质的细胞会发生分化或丧失功能,达不到研究的目的。如果能建立一种椎间盘器官整体培养的方法,就可以确保髓核细胞及其周围基质环境的完整,使细胞与细胞间、基质内部及细胞与基质间的相互作用成为可能,有利于细胞表型及功能的表达,还为研究基质间信号的传导和椎间盘对外界刺激的反应创造了一个实验平台,在椎间盘退变研究方面有一定优势,所以有必要椎间盘器官整体培养方法作相关探讨。第一章体外培养椎间盘器官目的：对大鼠椎间盘包括上下软骨终板、纤维环及髓核组织进行整体培养,观察髓核组织的变化,探索椎间盘器官整体培养的实用技术。方法：1、取健康清洁级SD大鼠60只,5-6周龄,150g左右,无菌条件下完整取出腰段椎间盘器官(包括髓核组织、纤维环、上下软骨终板及少量附着于终板的松质骨)共350个,随机分为5组；2、无菌条件下高渗肝素盐水冲洗椎间盘3次,2.5倍放大镜下进一步修整后置入12孔培养皿内,37℃、5%C02条件下培养,高渗DMEM／F12培养液通过每1000ml等渗培养液内加入3.72克NaCL获得,小牛血清浓度：20%,每天换液一次；3、任选10个椎间盘器官,随机分为两组,对照组5个椎间盘在培养前置入液氮内浸泡3次,每次浸泡1分钟左右,随后在两组椎间盘的培养液内均加入浓度为10mg／ml的NBT液240μl,吹打混匀,培养8小时后取出两组椎间盘,高渗盐水冲洗3次,10%福尔马林固定48小时,石蜡包埋,切片观察；4、任取75个椎间盘,随机分成5组,每组15个椎间盘,分别在培养的第0、3、7、14、21天取出1组椎间盘,高渗盐水冲洗3次,10%福尔马林固定48小时,石蜡包埋,切片观察；取出椎间盘前8小时在培养液内均加入浓度为10mg/ml的NBT液240μl,吹打混匀；5、任取10个椎间盘,随机分为5组,每组2个椎间盘,分别在在培养的第0、3、7、14、21天取出1组椎间盘,高渗盐水冲洗3次,10%福尔马林固定48小时,石蜡包埋,切片,厚度4-6μm,免疫组织化学染色观察；6、任取75个椎间盘,随机分成5组,每组15个椎间盘,分别在培养的第0、3、7、14、21天取出1组椎间盘,高渗盐水冲洗3次,10%福尔马林固定48小时,石蜡包埋,切片,厚度4-6μm,HE染色观察；7、任取75个椎间盘,随机分成5组,每组15个椎间盘,分别在培养的第0、3、7、14、21天取出1组椎间盘,高渗盐水冲洗3次,10%福尔马林固定48小时,石蜡包埋,切片,厚度4-6μm,番红O染色观察；8、任取100个椎间盘,随机分成4组,每组25个椎间盘,分别在培养的第0、3、7、14天取出1组椎间盘,高渗盐水冲洗3次,无菌条件下剖开椎间盘,每5个椎间盘取出1组髓核组织,每组重量约250μg,Trizol试剂裂解细胞,PCR测试基质蛋白表达。结果：1、可通过解剖获得完整无损的SD大鼠椎间盘器官,但软骨终板表面残留少量松质骨组织；2、NBT可对存活椎间盘细胞着色,而对死亡椎间盘细胞不着色；3、椎间盘器官体外培养两周内,髓核细胞成活率与对照组培养0天细胞成活率比较无统计学意义(P>0.05),培养21 d时成活率显著低于其余各时间点(P<0.01)：4、器官培养各时间点免疫组织化学染色均显示髓核细胞内含大量Ⅱ型胶原；5、椎间盘器官体外培养两周内,HE染色显示髓核组织结构完整,培养21天组髓核组织结构分解,细胞散在分布,完整性消失；6、椎间盘器官体外培养两周内,番红O染色显示基质结构完整,培养21天组显示基质染色不均匀,完整性消失,图像分析结果显示：培养14天内各时间点灰度值比较无统计学意义(P>0.05),培养21天组与其他各时间点灰度值比较均有统计学意义(P<0.05)；7、随着培养时间的延长,Ⅰ型胶原的mRNA表达呈上升趋势,而Ⅱ型胶原、核心蛋白聚糖和聚集蛋白聚糖的mRNA表达呈下降趋势,使用单因素方差分析结果显示各组间相比差异均有统计学意义。结论：1、NBT染料可用于鉴别器官培养条件下细胞成活与否；2、利用高渗培养液可对椎间盘器官进行整体培养,为椎间盘生理与病理研究提供了一种理想模型第二章皮下埋植培养大鼠椎间盘器官的可行性研究目的：体内皮下埋植培养椎间盘器官的可行性研究方法：1、取健康清洁级SD大鼠32只,5-6周龄,150g左右,无菌条件下完整取出腰段椎间盘器官(包括髓核组织、纤维环、上下软骨终板及少量附着于终板的松质骨)160个,随机分为6组；2、无菌条件下高渗肝素盐水冲洗椎间盘3次,2.5倍放大镜下进一步修整,置入含高渗培养液的培养皿,搁置于CO2孵箱内备用；3、取健康清洁级SD大鼠16只,5-6周龄,150克左右,5%水合氯醛麻醉,无菌条件下把已完整取出备用的椎间盘器官5个为1组埋植于麻醉大鼠背部皮下组织内,待大鼠苏醒后常规养殖；4、于培养的第3、7天各任选3只大鼠取出椎间盘器官15个,高渗盐水冲洗3次,10%福尔马林固定48小时,石蜡包埋,切片,厚度4-6μm,番红O染色观察；5、于培养的第3、7天各任选5只大鼠取出椎间盘器官25个,高渗盐水冲洗3次,无菌条件下剖开椎间盘,每5个椎间盘取出1组髓核组织,每组重量约250μg,Trizol试剂裂解细胞,PCR测试基质蛋白表达。结果：1、培养3、7天组番红O染色显示基质结构分解,染色极不均匀,图像分析结果显示培养0、3、7天组两两比较有统计学差异(P<0.01)；2、随着培养时间的延长,Ⅰ型胶原的mRNA表达呈上升趋势,而Ⅱ型胶原、核心蛋白聚糖和聚集蛋白聚糖的mRNA表达呈下降趋势。使用单因素方差分析结果显示各组间相比差异均有统计学意义(P<0.01)结论：体内椎间盘器官培养的条件及理想部位尚需进一步探讨