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昆虫的生活环境中存在大量的微生物,昆虫和微生物的接触部位主要是上皮组织。80%的已知动物会发生周期性蜕皮,而昆虫的体壁也具有周期性蜕皮的现象。昆虫蜕皮后的新体壁非常柔嫩,为了保护蜕皮后的个体免受病原菌入侵,在不断的进化过程中产生了一系列的防御机制。昆虫在蜕皮前新旧表皮之间产生蜕皮液,本研究发现蜕皮后蜕皮液仍然可以长时间残留在体壁上。蜕皮液不仅影响昆虫蜕皮过程的进行,还对刚蜕皮的昆虫提供了免疫保护。主要研究成果介绍如下: 通过收集蜕皮液、蛋白分离和质谱鉴定方法研究了昆虫蜕皮液蛋白质组组成,发现家蚕幼虫期到幼虫期蜕皮液共有109种蛋白,幼虫期到蛹期蜕皮液有99种蛋白,蛹期到成虫期有79种蛋白。根据其功能将这些蛋白分为如下几组:免疫蛋白、蛋白酶、氧化脱氢酶、水解酶、酯酶、腺苷三磷酸酶、丝氨酸蛋白酶、丝氨酸蛋白抑制剂、营养储存蛋白、结合蛋白、几丁质相关蛋白、表皮蛋白、Yellowproteins及其他蛋白。本文还主要对蜕皮液的相关功能进行了研究:1、蜕皮液中存在许多与先天免疫蛋白,其中包括多酚氧化酶(prophenoloxidase,PPO)激活通路相关的酶和抑制剂,体外试验证明蜕皮液具有抑菌作用。用白僵菌孢子体外感染幼虫期及化蛹期的家蚕,研究表明蜕皮期家蚕能够阻止白僵菌进一步的侵染。由此可见,蜕皮液在保护蜕皮期幼嫩个体不受致病菌侵染的过程中起重要作用。2、以完全变态昆虫赤拟谷盗(Tribolium castaneum)为模式研究了部分昆虫蜕皮液蛋白对蜕皮的影响。通过RNA干涉,发现蜕皮液中一些蛋白对于昆虫蜕皮调控有十分重要的作用,比如蛋白质及几丁质降解酶,分解活性氧的catalase、superoxide dismutase、peroxidasin-like heme peroxidase,调节蜕皮液压力平衡的Rennin-angiotensin system等蛋白。3、本研究还进一步探究了昆虫蜕皮液抵抗白僵菌入侵的作用机理。昆虫蜕皮液中存在多酚氧化酶并在蜕皮后的新体壁上残留较长时间,蜕皮液中的多酚氧化酶能够和白僵菌孢子结合。利用原核重组表达和纯化果蝇rPPO1发现rPPO1能够与白僵菌孢子直接结合。几丁质是真菌细胞壁的组成成分之一,在研究中发现rPPO1与白僵菌孢子的结合主要是通过与白僵菌孢子的几丁质结合实现的,在几丁质含量上升的绿僵菌突变体中孢子与rPPO1的结合能力明显提高,用几丁质酶消化的白僵菌孢子与rPPO1的结合力明显降低。此外,本研究还鉴定了rPPO1能够与白僵菌孢子结合的肽段,该片段有十个氨基酸519NQALNLEEQR528组成。与普通的白僵菌孢子相比,结合了rPPO1的白僵菌孢子也能够正常生长,但是其疏水性及粘附性都有明显降低,通过生测实验证明结合了rPPO1的白僵菌孢子对家蚕的致病性降低。因此蜕皮液中的多酚氧化酶在介导宿主和真菌的相互作用时起了很大的作用。 总之,本研究不仅鉴定了家蚕蜕皮液蛋白质组,还发现蜕皮液不仅影响蜕皮进行,在保护蜕皮后幼嫩个体不受病原菌侵害过程中也起了重要作用,这项研究对害虫生物防治可能具有重要指导意义。