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一.研究背景与目的热射病(heat stroke, HS)是一种急性热致疾患,具有高发病率及高死亡率的特点,典型表现为高热(>40℃)、无汗和意识障碍。HS是高发病率和死亡率的一种重症疾病,由于发病机制尚不清楚,因此临床缺乏有效的特异性治疗手段。尽管目前采取积极的降温和相应的脏器支持等处理措施,其死亡率仍居高不下。流行病学资料显示,极热期间,美国城镇地区热射病发生率为20/10万人,其潜在高病死率为10%-70%,而在沙特阿拉伯半岛,致死率在50%左右。我国尚缺乏系统流行病学调查,在军事训练中时有发生,可导致军事人员的减员或死亡。据不完全统计,在我国热射病病死率高达10%-15%,而一旦发展为热射病合并多器官功能障碍综合征(MODS),病死率可达40%以上。近年来,日益受到人们重视,相关研究方兴未艾。目前热射病的发病机制仍未完全清楚,国内外提出来如下学说：热直接损伤、热调节功能障碍、热应激异常、肠源性内毒素血症。其中,热应激状态下的肠源性内毒素血症是近年来热射病发病机制研究中的热点。枯否细胞(KC)是固定在肝内的巨噬细胞,占肝脏总体积的2.1%,承担体内单核巨噬细胞功能的80%-90%。KC一方面具有清除内毒素的功能(吞噬功能),另一方面又可被内毒素激活(分泌功能),产生大量细胞因子和炎性介质等活性物质。在热应激动物模型中,发现高热应激状态下门静脉血中内毒素明显升高,但早期在动脉系统中并未发现内毒素的存在,而此时肝脏和血浆炎症介质已呈现升高趋势,而这种肝脏局部和全身炎症介质的重要来源可能为肝脏KC。因此在热应激动物模型中研究KC功能变化情况及其对大鼠预后的影响可以进一步分析热射病状态下KC功能异常的病理生理过程,对于开发重症中暑的防治新药物靶点和新治疗措施提供可能的新途径,提高我军在热区环境下的战斗力都有着重要意义。二.方法1.大鼠热应激模型的建立实验动物准备及分组SPF级雄性Wistar大鼠80只(广州军区武汉总医院),体重250-300g,随机分为正常对照组(NC),41℃组,42℃组,43℃组,44℃组,各组14只大鼠,并对每只大鼠依次进行编号。热打击前20min内,每隔10min测量1次核心体温。热应激方法除正常对照组(NC)置于室温环境下,其余实验组大鼠均置入预热到30℃的仿真热气候动物舱,并于30min内使高温舱达到温度39℃,湿度65%的实验条件。此时记为热应激开始。期间各组大鼠每l0min连接Powlalr8sp生理记录仪,直肠内放置热电偶,测直肠核心体温(Tc),代表核心体温,每次测量时间1min。当各组大鼠到达各组预设核心体温即41℃.42℃.43℃.44℃时取出大鼠。实验期间禁食禁水。恢复期处理在恢复期,不做特殊处理,将大鼠放入环境温度25℃的室温环境下,恢复自由进食、水,并放回原饲养环境中继续监测8h内Tc变化情况及72h内的生存情况。2.体内吞噬功能的检测尾静脉注射印度墨汁(1：3生理盐水稀释,0.2ml／只),并于其后第2min(T1)和12min(T2)眼眶采血,经721型分光光度计：600nm波长,蒸馏水调零,测光密度值ODl、OD2,计算吞噬指数K值：K=(logOD1-logOD2)/(T2-T1)。肝脏经伊红染色,显微镜400倍视野观察吞噬碳粒的枯否细胞,比较各组密度差异。3.内毒素、分泌功能检测分别于门静脉、外周血管采血,ELLSA检测血中内毒素水平、TNF-α、IL-1β、IL-6水平的变化。4.体外KC提纯通过原位灌注及胶原酶离体灌注的方法制备成肝细胞悬液后,将肝细胞悬液85g离心5min(4℃),吸取上清至另一50ml离心管中,将离心管液体增至45ml混悬细胞,550g离心6min(4℃),去除细胞上清液,将沉淀重悬至12ml并充分混匀。另取4支15ml离心管,倾斜60。,沿管壁分别加入50%的percoll3.8ml,25%percoll5ml,细胞悬液3ml。800g离心20min(4℃),缓慢吸去上层液体,留取50%percoll层液体用等体积培养液稀释,950g离心10min(4℃).将末次离心后的枯否细胞(KC)沉淀用无血清培养液重悬后1000r离心5min,去上清留沉淀,重复以上操作三次。之后沉淀用含20%胎牛血清培养液重悬并放入培养瓶。6h后用温PBS轻轻冲洗3次,去除未贴壁细胞。贴壁细胞即为高纯度的枯否细胞(KC)。5.KC热应激实验新提取的KC在细胞培养箱中按照预设好的温度梯度分别进行热打击,即N、41℃、42℃、43℃、44℃,打击时间均设为1h。并根据体内检测内毒素含量,在热应激的同时加入等比例的LPS。之后利用流式细胞术及ELLSA分别检测吞噬功能及分泌功能。三.结果：1.热应激模型结果随热应激的程度不同,大鼠Tc呈现不同的特征性改变。热应激期间,41℃和42℃组大鼠表现为双相式T。上升；而43℃和44℃组大鼠表现为三相式Tc上升。脱离热应激后,41℃和42℃组大鼠T。在1h内恢复正常水平,43℃和44℃组而出现低T。,以44℃组为明显。41℃和42℃组大鼠72h内未出现死亡,43℃和44℃组出现不同比例的大鼠死亡,以44℃组死亡率为高(P<0.01)。生存分析显示,44℃组大鼠预后显著差于43℃组大鼠(P<0.01)。2.体内检测吞噬功能实验结果N组吞噬指数K值为1.516±0.583；41℃组K值为2.553±0.485;42℃组K值为2.167±0.469；43℃组K值为1.624±0.451；44℃组K值为0.923±0.351。即N至41℃时KC吞噬功能活化,吞噬功能逐渐增强；42℃、43℃、44℃温度逐渐升高,吞噬功能受到抑制,吞噬功能逐渐下降。各组间K值有显著差异(P<0.05)。3.体内内毒素、分泌功能检测结果N组门静脉LPS浓度为11.49±0.43u/l,外周血LPS浓度为6.35±0.33u/l；41℃组门静脉LPS浓度为13.32±0.46u/l,外周血LPS浓度为9.56±0.55u/l；42℃组门静脉LPS浓度为29.79±0.61u/l,外周血LPS浓度为26.98±0.64u/l；43℃组门静脉LPS浓度为63.35±0.72u/l,外周血浓度为61.56±0.70u/l；44℃组门静脉LPS浓度为85.16±0.79u/l,外周血浓度为86.65±0.75u/l。各组LPS浓度有显著性差异(p<0.05)。N组IL-1β浓度为11.1±0.52ng/l、IL-6浓度为43.34±0.62ng/l、TNF-α浓度为93.15±0.73ng/l；41℃组IL-1β浓度为21.21±0.34ng/1、IL-6浓度为81.24±0.58ng/l、TNF-α浓度为156.15±0.64ng/l；42℃组IL-1β浓度为52.53±0.55ng/l、IL-6浓度为200.12±1.61ng/l、TNF-α浓度为203.65±1.54ng/l;43℃组IL-1β浓度为106.43±1.47ng/l、IL-6浓度为414.24±2.68ng/l、TNF-α浓度为414.84±3.71ng/l；44℃组IL-1β浓度为144.86±2.67ng/l、IL-6浓度为584.23±3.67ng/l、TNF-α浓度为929.15±6.39ng/l。各组间IL-1β、IL-6、TNF-α均有显著差异(p<0.05)。4.体外KC吞噬功能检测结果利用流式细胞技术,吞噬指数表示为如下图中Q2/Q2+Q4。实验中对照组吞噬指数为48.13±0.44%,41℃组吞噬指数为88.23±0.36%,42℃组吞噬指数为80.65±0.42%,43℃组吞噬指数为50.12±0.31%,44℃组吞噬指数为27.23±0.42%。对照组、41℃组、42℃组吞噬功能活化,吞噬指数逐渐增加；43℃组、44℃组吞噬功能下降,吞噬指数逐渐减少。各组间有显著差异(P<0.05)。5.体外分泌功能检测结果N组IL-1β浓度为5.1±0.49ng/l、IL-6浓度为17.34±0.55ng/l、TNF-α浓度为43.45±0.53ng/1；41℃组IL-1β浓度为11.98±0.44ng/l、IL-6浓度为38.24±0.55ng/l、TNF-α浓度为78.98±0.74ng/1；42℃组IL-1β浓度为27.53±0.35ng/l、IL-6浓度为95.22±0.51ng/l、TNF-α浓度为98.65±0.77ng/l；43℃组IL-1β浓度为60.43±0.76ng/l、IL-6浓度为201.24±1.68ng/l、TNF-α浓度为199.84±1.71ng/l;44℃组IL-1β浓度为78.86±2.67ng/l、IL-6浓度为221.23±2.47ng/l、TNF-α浓度为476.15±3.39ng/l。各组间IL-1β、IL-6、TNF-α均有显著差异(p<0.05)。四.结论随着热应激程度的增强,大鼠体内内毒素含量不断升高,小剂量内毒素可以增强单核巨噬细胞系统功能,活化KC,而当内毒素含量过高时则免疫抑制,KC吞噬功能低下,而分泌功能增强。另研究表明,恢复期低体温水平与热应激期时达到的最大核心体温水平成正相关。即热应激时达到的核心体温越高,恢复期的低体温程度越深。正常的动物中,由于外界的热量感受器刺激核心体温的下降并且传送给下丘脑信息,使其综合并刺激出相应的活动,去维持体温调节的控制和阻止致命性的低体温的发生。由于热应激水平高的大鼠这种能力的缺乏,因而不能从自主性低温中恢复,发展成为不受控性的低体温。由于热应激后存在多种并发症,在热应激恢复过程中可检测到多种细胞因子的升高,我们认为低体温的发生可能与细胞因子的升高有关,而细胞因子的产生与KC的功能改变有关系,因此,KC的功能变化对大鼠热应激恢复期低体温及预后是有影响的。