肌萎缩侧索硬化(Amyotrophic lateral sclerosis,ALS)是一种成人起病的、进行性、致死性神经系统变性疾病,病变累及皮层、脑干及脊髓前角运动神经元,导致全身肌肉的进行性萎缩、无力。患者多于发病后的3~5年内因呼吸肌萎缩无力而死亡。由于其发病机制的复杂性,目前尚无有效的治疗方法。ALS的患病率约为5~7/10万,其中约90%为散发型肌萎缩侧索硬化(SALS),其余10%为家族性肌萎缩侧索硬化(FALS),约20%的FALS是由铜/锌超氧化物歧化酶1基因(SOD1)的突变引起。SOD1-G93A转基因小鼠为SOD1基因93号位点发生甘氨酸→精氨酸的突变,高度模拟人类ALS疾病的病理及临床特点,被广泛地应用于ALS病理机制的研究。ALS的病理机制目前尚未完全明确,已知的有蛋白错误折叠、兴奋性氨基酸毒性、线粒体损伤、氧化应激等,近年来,一些新的证据表明D-丝氨酸(D-serin,D-Ser)—一种内源性的N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)的协同激动剂,在ALS病人中有所升高,并可加剧运动神经元的死亡。而造成D-Ser升高的主要原因在于D-氨基酸氧化酶(D-amino acid oxidase DAO)的活性降低。DAO是一种以黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)为辅基的典型黄素蛋白酶类,可氧化D-氨基酸如D-丙氨酸、D-丝氨酸、D-脯氨酸的氨基生成相应的酮酸。DAO广泛存在于哺乳动物的中枢神经系统(CNS)、肝脏及肾脏,在CNS主要存在于脑干和脊髓。在哺乳动物和低等生物如酵母、真菌和细菌的DAO蛋白之中,Arg199残基紧靠FAD结合位点,处于Tyr228和His307残基之间,对酶活性起着至关重要的作用。发生于此位点的突变(R199W)会在细胞中引起不良后果,可导致ALS的发生发展。研究认为,脊髓内存在的高水平的DAO主要作用在于降解D-Ser,从而通过NMDAR介导的神经毒性调控神经元的存活。而不论在f ALS患者中还是在SOD1-G93A模型小鼠中,腰髓DAO水平均有所降低。我们设想补充ALS小鼠模型腰髓中的DAO水平可能会增加D-Ser的降解,从而减轻NMDAR过度激活造成的神经毒性,保护运动神经元。自1952年DNA被发现作为遗传物质以来,利用载体(如病毒)携带DNA以治疗遗传性疾病的方法便应运而生。常用于转导中枢神经系统的载体有包含质粒的纳米颗粒、逆转录病毒重组载体、腺相关病毒(AAV)、腺病毒和单纯疱疹病毒(HSV)。其中AAV已成为最安全、最常用的一种用于传递治疗基因的病毒载体。本研究应用CMV启动子调控下的单链腺相关病毒血清9型(ss AAV9),携带编码的小鼠DAO基因(ss AAV9-DAO)经鞘内注射的途径干预发病早期的SOD1-G93A转基因小鼠,观察上调小鼠腰髓内的DAO的水平对其行为学及病理表现的影响,并进一步探索其可能的机制。我们查阅文献尚未见类似报道。第一部分ALS小鼠模型中DAO的表达及分布目的:我们对不同时期(60天龄—症状前期、90天龄—症状早期、120~140天龄—终末期)的SOD1-G93A转基因小鼠腰髓组织内的DAO水平进行检测,观察DAO水平随病程进展发生的变化,并进一步观察DAO所在的细胞类型,为病毒载体系统的选择提供依据。方法:我们选取由美国Jackson实验室提供的SOD1-G93A转基因小鼠作为动物模型,并应用其提供的引物序列和鉴定方法进行DNA鉴定,鉴定阳性的60天、90天及终末期小鼠作为研究对象,并以相同天龄的阴性小鼠作为阴性对照(即60天阳性、60天阴性、90天阳性、90天阴性、终末阳性、终末阴性共6组),每组4只小鼠。小鼠新鲜取材后采用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测小鼠腰髓DAO的表达水平。另取90d阳性小鼠3只,灌注取材后行25μm震荡切片,采用免疫荧光共聚焦技术(confocal)观察DAO主要存在的细胞类型。结果:1与阴性鼠比较,SOD1-G93A小鼠腰髓DAO蛋白水平在终末期显著减少(P<0.05),其他时期则无显著变化。2免疫荧光共聚焦染色结果显示SOD1-G93A小鼠腰髓DAO主要表达在运动神经元,此外星形胶质细胞和小胶质细胞也有极少量的表达。结论:SOD1-G93A小鼠腰髓组织内的DAO表达在终末期时显著减少,说明了补充腰髓DAO可能对SOD1-G93A小鼠具有保护作用;SOD1-G93A小鼠腰髓中DAO主要存在于运动神经元,这对选取神经元靶向的载体系统提供了依据。第二部分鞘内注射ss AAV9在SOD1-G93A转基因小鼠脊髓转导效率的研究目的:通过给SOD1-G93A转基因小鼠鞘内注射ss AAV9-GFP和ss AAV9-DAO,观察在此种方法下,绿色荧光蛋白(GFP)在SOD1-G93A小鼠脊髓内的分布情况及转导效率,以及小鼠腰髓组织DAO及D-Ser表达的变化,以确定此种方法的可行性。方法:选取SOD1-G93A转基因小鼠作为研究对象,单次鞘内注射ss AAV9-GFP(1×1012vg/kg)或ss AAV9-DAO(1×1012vg/kg),给药3周后部分小鼠以4%的多聚甲醛液灌注固定,行脊髓组织25μm震荡切片,部分小鼠新鲜取材,分离腰髓组织。通过免疫荧光共聚焦技术观察GFP表达及分布情况,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测小鼠腰髓DAO的表达水平,免疫组织化学染色法观察小鼠腰髓D-Ser的表达。结果:1脊髓切片免疫荧光染色显示腰髓可见较多GFP表达,另外骶髓、胸髓也有少许GFP表达,颈髓则很少见。2免疫荧光共聚焦染色显示GFP与神经元共定位,而不表达于星形胶质细胞和小胶质细胞,且SOD1-G93A转基因小鼠腰髓运动神经元转导效率约为12%。3 Western blotting结果显示ss AAV9-DAO组小鼠腰髓组织DAO表达明显增多,同时免疫组织化学染色结果显示,与ss AAV9-GFP组小鼠相比,ss AAV9-DAO组小鼠腰髓组织D-Ser阳性细胞数显著减少。结论:GFP主要表达于注射点附近的脊髓部位,腰髓为主;GFP主要表达于神经元,且腰髓运动神经元转导效率约为12%;ss AAV9-DAO单次鞘内注射可增加SOD1-G93A小鼠腰髓内的DAO表达,同时降低D-Ser水平。说明了此种给药方式可补充小鼠腰髓内的DAO水平并具有酶活性。第三部分鞘内注射ss AAV9-DAO对SOD1-G93A转基因小鼠行为学影响及机制研究目的:通过给SOD1-G93A转基因小鼠鞘内注射ss AAV9-DAO,观察过表达DAO对SOD1-G93A小鼠生存期、体重、转轮试验及组织病理改变的影响,并探索相关的保护机制。方法:选取由美国Jackson实验室提供的SOD1-G93A转基因小鼠作为ALS动物模型,并应用其提供的引物序列和鉴定方法进行DNA鉴定,选择同窝配对的阳性鼠作为受试对象。小鼠90天龄时,选取体重接近(组间平均起始体重差别≤0.3g)的同窝小鼠,雌、雄各15对,随机分配到治疗组和对照组,分别给予ss AAV9-DAO和ss AAV9-GFP鞘内注射,观察小鼠体重、转轮变化及生存期。另外选取给予同样干预方法的小鼠进行机制研究,给药3周后取材,其中3对用0.05%的戊二醛-多聚甲醛液灌注固定,腰髓25μm震荡切片,通过免疫组织化学染色法观察SMI-32、Iba-1、GFAP的改变;L5前根切片甲苯胺蓝染色观察轴索破坏情况;余4对新鲜取材,腓肠肌冰冻切片HE染色观察肌纤维情况;通过蛋白免疫印迹法检测腰髓TNF-α、IKBα、IKKβ、IKKγ、p-P65、p-Akt、Bcl-2、Bax、Caspase3、Caspase9、Cd11b、GFAP的水平。结果:1与ss AAV9-GFP组小鼠相比,ss AAV9-DAO组小鼠生存期延长6天,差异有统计学意义(n=30,P<0.05),其中,雌鼠延长8天,差异显著(n=15,P<0.05),雄鼠也延长8天,但差异无统计学意义(n=15,P>0.05)。雄鼠两组间的体重、转轮均无显著差异;雌鼠ss AAV9-DAO组仅在110天龄时短暂改善转轮表现(P<0.05),体重则无显著差异。2免疫组织化学染色结果显示,与ss AAV9-GFP组小鼠相比,ss AA V9-DAO组小鼠腰髓组织SMI32表达增多、GFAP、Iba-1表达减少,同时Western blotting结果显示,ss AAV9-DAO组小鼠腰髓组织Cd11b、GFAP表达较对照组减少。即治疗组腰髓运动神经元保留较对照组明显增多,而星形胶质细胞、小胶质细胞增生较对照组明显减少。3 L5前根切片甲苯胺蓝染色结果显示,与对照组小鼠相比,给药组小鼠L5前根保留的轴索数量明显增多。腓肠肌冰冻切片HE染色结果显示,对照组小鼠肌纤维大小不一,可见大量中央核,给药组较之有所改善。4腰髓组织Western blotting结果显示,与ss AAV9-GFP组相比,ss AAV9-DAO组的NF-κB信号通路正向调节因子IKKβ、IKKγ水平显著降低,而负向调节因子IKBα显著增高,另外反映NF-κB信号通路激活状态的p-P65、TNF-α水平均显著降低(P<0.05)。同时,ss AAV9-DAO组促凋亡因子Bax、Caspase3、Caspase9均显著降低,而抗凋亡因子Bcl-2显著增高,且伴有p-Akt表达的增高(P<0.05)。结论:ss AAV9-DAO单次鞘内注射可延长症状期SOD1-G93A小鼠的生存期,但存在性别差异,造成此种差异的原因尚不完全明确。但对体重、转轮表现的改善不显著;ss AAV9-DAO可减少SOD1-G93A小鼠腰髓运动神经元的丢失和小胶质细胞、星形胶质细胞的增生活化,并对前根的轴索及肌肉纤维也具有一定保护作用;DAO的保护作用可能与其抑制NF-κB的激活从而抑制炎症反应,抑制Akt的失磷酸化从而减少凋亡反应有关。确切的机制尚有待进一步研究。