研究目的:本实验利用可控性皮质损伤装置(CCI)装置成功建立大鼠颅脑创伤模型,及可控性细胞损伤装置(CIC-II)装置成功建立颅脑创伤的细胞模型并运用此模型进行:(1)探讨亚低温对颅脑创伤(TBI)后大鼠脑组织受体相互作用蛋白激酶-1(RIPK-1)表达的影响。(2)对RIPK-1介导的坏死性凋亡通路中神经细胞坏死性凋亡的分子机制进行探索并揭示重要蛋白在通路中的相互作用。(3)研究亚低温对坏死性凋亡通路保护作用的分子机制。(4)FADD在RIPK-1介导的坏死性凋亡通路中的作用。研究内容与方法:本实验分为两个部分:即动物实验部分和细胞实验部分。实验一:利用可控性皮质损伤装置(CCI)建立大鼠颅脑创伤模型并给予多种方法系统评价造模准确性。实验二:应用可控性细胞损伤装置(CIC-II)装置成功建立颅脑创伤的细胞模型并就细胞形态学等特征进行系统评价研究。实验一:健康成年Wistar大鼠40只,将其随机分成4组:Sham组(假手术)开骨窗不予打击、伤后不给予亚低温治疗,Sham+HT组(假手术+亚低温)开骨窗不予打击而后亚低温干预8小时,TBI组(手术)开骨窗后应用CCI装置打击致伤,参数设置为:速率(v)4m/s,深度(d)2mm,持续时间(t)120ms,TBI+HT组(手术+亚低温)开骨窗,CCI打击致伤(前后打击参数保持一致),伤后采取亚低温治疗时间统一定为8小时,待动物苏醒后,在伤后1天和2天进行神经功能缺陷综合评分(n=10),后进行亲神经特殊染料(甲苯胺蓝)的脑组织染色实验;Western-blot测定大鼠皮层RIPK-1,RIPK-3,FADD,PARP-1,Caspase-3,Caspase-8,TNF-α,TRAIL,and Fas L的表达;Real-time PCR测定大鼠皮层RIPK-1,RIPK-3,FADD,PARP-1,Caspase-3,Caspase-8,TNF-α,TRAIL,and Fas L的m RNA表达;脑组织HE染色、免疫组化染色;脑组织DNA免疫荧光实验;透射电子显微镜检测脑组织坏死后亚细胞结构变化;Fluoro-Jade.C(FJC)脑组织染色;大鼠脑组织血流量测定。实验二:SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞的培养,应用CIC-II梯度打击SH-SY5Y并评价,常规培养胰酶消化SH-SY5Y细胞,准备生物硅胶模培养皿,每个生物硅胶模培养孔内加入2ml细胞悬液,混匀,置入培养皿内培养24h,以使之贴壁生长,次日取出生物硅胶模培养皿,置于CIC-II仪器之下,第一孔不打击,其余各孔各打击1-4次,打击中不间隔;在每孔中分别加入FJC、PI、DAPI行免疫荧光染色,观察细胞形态学变化及细胞死亡情况;SH-SY5Y细胞分为四组,接种于6孔板。分别为假手术组(Sham组):不予CIC-II打击、伤后不给予亚低温干预,假手术组+亚低温组(Sham+HT组):不予CIC-II打击、伤后亚低温干预8小时,手术组(TBI组):CIC-II打击、伤后不予亚低温干预,手术组+亚低温组(TBI+HT组):CIC-II打击、伤后给予亚低温干预8小时,次日取出四组细胞,处理后流式细胞仪分析检测。结果:1.伤后24h、48h神经功能评分结果:TBI+HT组较TBI组NSS评分明显降低(P<0.01)。本实验提示HT治疗能改善颅脑创伤大鼠的神经功能缺陷症状,且随时间延长,低温干预的远期疗效呈增加态势(*P<0.05,**P<0.01);(##P<0.05)。2.Real-time RT-PCR验证大鼠脑组织目的基因表达情况:根据Real-time RT-PCR结果显示各组RIPK-1,RIPK-3,FADD,PARP-1,TRAIL,Caspase-3,Caspase-8,TNF-α,and Fas L相对表达量:与Sham组相比,其余各组大鼠脑组织中目的基因RIPK-1,RIPK-3,FADD,PARP-1,TRAIL,Caspase-3,Caspase-8,TNF-α,and Fas L m RNA表达量均有不同程度的增加;TBI组及TBI+HT组m RNA表达量较假手术组明显增加,且差异具有统计学意义(*P<0.05,**P<0.01);TBI组及TBI+HT组相比,亚低温干预后,TBI+HT组大鼠脑组织中目的基因RIPK-1,RIPK-3,FADD,PARP-1,TRAIL,Caspase-3,Caspase-8,TNF-α,and Fas L m RNA表达量明显下降,差异具有统计学意义(*P<0.05,**P<0.01)。3.Western-blot实验结果:与Sham组相比,余大鼠脑组织中RIPK-1,RIPK-3,FADD,PARP-1,TRAIL,Caspase-3,Caspase-8,TNF-α,and Fas L表达量均有不同程度的增加;TBI组及TBI+HT组目的蛋白表达量较假手术组明显增加,且差异具有统计学意义(*P<0.05,**P<0.01);TBI+HT组大鼠脑组织中目的蛋白RIPK-1,RIPK-3,FADD,PARP-1,TRAIL,Caspase-3,Caspase-8,TNF-α,and Fas L表达量明显下降,差异具有统计学意义(*P<0.05,**P<0.01)。4.透射电镜观察大鼠TBI造模后神经元胞核及线粒体结构:Sham组脑组织超微结构中的线粒体和胞核未见明显异常改变,TBI组的神经细胞变化主要有细胞核型不规则,胞浆内网状组织肿胀,胞浆减少,核内染色质边集等坏死和凋亡的特征性改变线粒体密集成簇,出现马蹄形或环形扭曲,线粒体膜产生细小空泡,内部线粒体嵴结构崩解消失。5.HE染色观察大鼠皮层及海马神经细胞:TBI组可见不同程度损伤,皮层损伤区含有大量红细胞,在Sham组及Sham+HT组,神经细胞结构及数目无明显异常;在TBI组,皮层及海马部位神经细胞有损坏性改变。在TBI+HT组,红细胞数目在皮层损伤区域有明显降低,神经细胞结构及功能损坏不明显。6.FJC染色阳性细胞评价TBI大鼠造模后神经元变性坏死:本实验中,应用FJC染色TBI后大鼠脑组织切片有明确阳性发现。FJC染色阳性部位切片可见多个绿染神经元细胞,未行CCI打击的大鼠脑组织FJC染色未见明显阳性发现,这种绿染的阳性神经细胞在皮质损伤周边区域更加明显,数量也较多。7.大鼠脑组织免疫组织化学染色及脑组织内TRAIL+PARP-1+DNA免疫荧光三染结果:观察区域为大鼠损伤侧皮层,RIPK-1,RIPK-3,FADD,PARP-1,Caspase-3,Caspase-8免疫阳性产物主要定位于神经元胞质内;TNF-α,and Fas L免疫阳性产物主要定位于神经元胞膜。Sham组和Sham+HT组中RIPK-1,RIPK-3,FADD,PARP-1,Caspase-3,Caspase-8,TNF-α,and Fas L免疫阳性产物较创伤组表达量低,TBI组中RIPK-1,RIPK-3,FADD,PARP-1,Caspase-3,Caspase-8,TNF-α,and Fas L免疫活性明显增加,而与TBI组比较,TBI+HT组中RIPK-1,RIPK-3,FADD,PARP-1,Caspase-3,Caspase-8,TNF-α,and Fas L免疫活性则有不同程度上的降低。PARP-1荧光阳性区域与DAPI重叠,提示PARP-1为胞核内表达,TRAIL免疫银光染色阳性区域集中于神经细胞包膜。8.多普勒超声脑血流量检测结果:TBI干预后使得大鼠损伤周边血流量(TBI组及TBI+HT组)与Sham组相比显著下降(**P<0.01),在TBI造模后给予亚低温干预后,复测大鼠脑血流量,结果显示:与TBI组大鼠脑血流量相比,打击损伤周边区域皮质的脑血流量有所增加,组间比较增加的脑血流量有统计学意义(**P<0.01)。9.应用CIC-II梯度打击SH-SY5Y细胞形态学观察及PI免疫荧光染色:对照组细胞形态基本保持不变,随打击次数的增加,死亡细胞数量逐渐增多,此外,CIC-II打击后的SH-SY5Y细胞胞体变小、变圆,伸出的轴突缩短,树突样突起数目减少,单个细胞形态更为多样化,提示细胞处于坏死、凋亡期,且随打击次数增加,这种趋势更为明显,进一步的PI免疫荧光染色结果补充证明这一现象,说明应用CIC-II打击SH-SY5Y细胞可以良好的复制体外TBI模型。10.应用激光全息细胞成像系统(SUN-BIO M3)观察记录SH-SY5Y各参数及PI染色应用流式细胞术观察记录SH-SY5Y凋亡周期:应用SUN-BIO M3观察记录SH-SY5Y细胞参数可供研究分析细胞物理特性,随打击次数增加,细胞死亡率呈现增加趋势;细胞平均突起增多;细胞变得更加粗糙,后又规则以及细胞平均形状凸率先下降又升高,细胞文理变得杂乱不规则,细胞平均厚度增加提示细胞皱缩,体积不变情况下,单个细胞厚度增加;细胞平均周长变短,细胞平均不规则度下降,提示细胞突起减少,细胞汇合度明显下降,组间比较增加、减少值有统计学意义(*P<0.05、**P<0.01)11.流式细胞术观察记录SH-SY5Y细胞凋亡周期:正常组(control)及正常+亚低温组(control+HT)细胞有少量调亡,G1峰形态无明显提前,在应用CIC处理过的细胞应用PI染色流式细胞术观察记录SH-SY5Y细胞凋亡周期时可见明显的G1峰提前,即sub-G1峰,提示SH-SY5Y细胞出现明显的凋亡坏死趋势,低温干预CIC处理过的细胞后,可见G1峰延迟现象得到纠正,无明显sub-G1峰,凋亡率为(16.8±1.27)%,其中,正常组(control)及正常+亚低温组(control+HT)细胞调亡率差异无统计学意义,TBI组与TBI+HT组相比,调亡率差异有统计学意义(*P<0.05),应用亚低温干预可以明显保护细胞免受损伤。结论:实验得出以下三个结论:(1)外伤后的RIPK-1表达量呈现增加趋势,在用于亚低温这一干预手段之后可以显著降低TBI大鼠RIPK-1的上调表达。(2)在坏死性凋亡通路中,RIPK-1–RIPK-3所组成的坏死性凋亡诱导蛋白复合体是TBI后RIPK-1介导的坏死性凋亡通路的核心关键因子,发挥中心启动子作用。(3)FADD可以作用于坏死性凋亡通路上游特异性受体,在RIPK-1上游信号蛋白介导的信号通路中发挥抑制作用,TBI后RIPK-1介导的坏死性凋亡通路的激活可以被FADD所积极阻断,从而影响神经细胞的程序性坏死进程,促进研究TBI的新型药物作用靶点。