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研究背景:糖尿病(diabetes mellitus,DM)是当前威胁全球人类健康的最重要的非传染性疾病之一。随着糖尿病患者不断增加,糖尿病性视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)也已成为严重的全球性问题,它占所有失明患者总数的5%。DR是糖尿病最常见的微血管并发症之一,它的主要特征是视网膜微血管的闭塞和渗出,引发黄斑水肿,缺血缺氧促使视网膜形成新生血管,发生增殖性糖尿病性视网膜病变(proliferative diabetic retinopathy,PDR),从而容易使视网膜玻璃体出血,有的进而造成牵拉性视网膜脱离(tractional retinal detachment,TRD),使患者视力严重受损,甚至导致失明。目前,多数研究认为DR发生发展的主要原因是持续高血糖导致的一系列代谢异常,它可以引起视网膜的微血管系统受损,通透性发生改变,血-视网膜屏障遭到破坏。但是严格控制血糖水平并不能完全阻止DR的发生,并且DR具有家族聚集倾向,不同种族糖尿病患者的DR发生率也不相同。由此可见,糖尿病视网膜病变的发病机制十分的复杂,有待进一步研究。自噬是一种对细胞内成分降解再利用的保守进化过程,也是维持细胞稳定的重要过程。自噬在一定条件刺激下,使得衰老和受损的细胞器发生生理周转,从而通过各种不同的信号通路来控制细胞。糖尿病会加重视网膜及其毛细血管细胞中的炎症反应,增加晚期糖基化终产物(AGEs)和氧化应激;大量的证据表明,氧化应激与DR发展中涉及的其他代谢异常之间存在着联系,越来越多的数据强调了活性氧(ROS)在自噬激活中起了关键作用。这为自噬在DR中的研究提供重要线索。微小RNA(microRNAs,miRNAs)是一类广泛存在于生物体内,20-25个碱基长度的非编码单链RNA。miR-204是由位于染色体9q21.12上的TRPM3大内含子6表达。研究表明,有microRNA参与糖尿病病程,miR-375和miR-9在胰岛素合成和胰腺细胞释放中具有重要作用;miR-103,miR-107,miR-143,miR-144和miR-145也可以通过调节胰岛素受体通路的几个步骤调节肝脏组织和骨骼肌的外周胰岛素敏感性。在眼部结构中,miR-204参与年龄相关性白内障、糖尿病角膜等疾病的发生和发展。这使得miR-204和自噬成为本研究的切入点,为我们对糖尿病性视网膜病变的分子机制的研究提供了新的视角。目的:测定DR大鼠视网膜中miRNA-204的表达情况,LC3Ⅱ蛋白水平,探讨二者间的相互关系及其对于DR发生发展的相关作用及机制。方法:将体重200克左右的雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠随机分为对照组(control组)和糖尿病性视网膜病变组(DR组)。DR组是按60mg/kg体质量进行腹腔注射STZ,建立DR大鼠模型;control组腹腔注射等量柠檬酸缓冲液作为对照。分别于72h、1w、4w、8w测量各组大鼠体质量、血糖等一般生理指标,于10w随机抽样对大鼠视网膜组织进行HE染色,确定DR大鼠模型建立。剔除血糖不达标大鼠,将实验大鼠分为control组、DR0组、DR组、anti-miR组、mimic组,共5组,每组n=10。利用实时定量PCR(qRT-PCR)技术,对DR大鼠视网膜和control大鼠视网膜分别进行检测,从中了解miRNA-204是否存在差异性表达。利用western blot技术,在蛋白水平检测LC3Ⅱ在DR大鼠视网膜中相对于control大鼠视网膜是否有所改变。利用腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV),将miR204-5p、antimiR204-5p分别包装至病毒载体(AAV-U6-Anti-rno-miR-204-5p-CAG-EGFP;AAVU6-mimic-rno-miR-204-5p-CAG-EGFP);将上述AAV载体介导体内表达,使DR大鼠视网膜中差异性表达miR204-5p,再运用western-blot检测DR大鼠视网膜中LC3Ⅱ的表达是否有影响。结果:通过qRT-PCR检测大鼠视网膜组织miR-204-5p水平,结果表明,相对于control组大鼠,miR-204-5p在DR组大鼠中的表达显著增高。通过Western blot检测大鼠视网膜组织LC3Ⅱ蛋白水平,结果表明,相对于control组大鼠,LC3Ⅱ在DR组大鼠中的表达被明显抑制。将AAV载体介导体内表达后,通过qRT-PCR检测大鼠视网膜组织miR-204-5p水平,通过Western blot技术在蛋白水平检测了AAV载体介导miR204-5p在DR大鼠视网膜组织中差异性表达后自噬相关蛋白LC3Ⅱ的表达,结果表明,相对于DR组大鼠,anti-miR组大鼠视网膜中LC3Ⅱ的表达被明显抑制。结论:在早期糖尿病性视网膜病变中,miR-204-5p对LC3Ⅱ的表达起到了负调控的作用。