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白血病是严重危害人类生命健康的造血系统恶性肿瘤,是由于造血干细胞增殖分化异常而导致的。迄今,白血病的治疗仍主要采用大剂量联合化疗与放疗,此疗法副作用甚大,复发率高,尤其对机体免疫与造血系统有极大损害。在众多的研究中,中药以其增强免疫功能、功补兼施、毒副作用小、注意整体、应用范围广泛的优越性得到了广泛认可和重视。从祖国医学宝库中寻找出能抑制白血病细胞恶性增殖的天然中药,已成为治疗白血病的重要途径。人参是我国传统中草药,其有效化学成分为人参皂苷,人参皂苷的药理作用广泛,特别是在肿瘤的治疗方面具有很高的药用价值。近年来已有研究表明人参皂苷能抑制白血病细胞增殖、促进凋亡、诱导分化、能增加化疗药物的敏感性和逆转耐药等,但具体作用机制仍不清楚。目前从人参中提取的确定的人参皂苷单体有30多种,其药理效应和作用机制不尽相同。其中人参皂苷Rbl、Rgl、Re是人参皂苷的主要成份。研究表明人参皂苷Rb1( ginsenoside Rb1,Rb1)具有抑制直肠癌增殖、增加化疗药物的敏感性;人参皂苷Rgl( ginsenoside Rg1, Rg1)具有抗氧化、促进记忆、增强免疫多种生物活性,近年来被证实可以诱导黑素瘤细胞凋亡、抑制宫颈癌Hela细胞的增殖和代谢活性[6];但抗白血病的机制还未见深入报道。而关于人参皂苷Re(ginsenoside-Re,Re)的抗肿瘤作用鲜有报道。本研究分为两部分进行实验:1.探讨人参皂苷Rb1、Rg1、Re对KG1a白血病细胞株体外增殖的影响及其可能的作用机制;2.人参皂苷Rb1、Rg1、Re对K562白血病细胞体外增殖的影响及其可能的作用机制。为发现与寻找调控白血病细胞增殖、或凋亡的分子靶点奠定基础,为临床治疗血液学疾病提供理论基础。1.人参皂苷Rb1、Rg1、Re对KG1a白血病细胞株增殖影响及信号转导机制的研究目的:探讨人参皂苷Rb1、Rg1、Re对急性髓系白血病细胞株KG1α增殖的影响,并进一步阐述可能的分子机制。方法:1.实验分组:阴性对照组,常规培养;人参皂苷Rb1组,常规培养基础上加不同浓度的Rb1(20μmol/L、40μmol/L、60μmol/L、80μmol/L、100μmol/L、120μmol/L、160μmol/L);人参皂苷Rg1组,常规培养基础上加不同浓度的Rg1(5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L );人参皂苷Re组,常规培养基础上加不同浓度的Re(30μmol/L、60μmol/L、90μmol/L、120μmol/L、150μmol/L)。分别培养24h、48h、72h,收集各组细胞进行以下研究。2.MTT法检测对白血病细胞体外增殖的影响,并计算细胞抑制率。3.流式细胞术检测Rb1(120μmol/L)对KG1α细胞周期分布及细胞凋亡的影响。4.瑞士染色观察Rb1作用48h后细胞形态学变化;5.Western blotting法检测Rb1诱导不同时间后KG1α细胞内p38/Phospho-p38, Erk/Phospho-Erk, JNK/Phospho-JNK和p53/Phospho-p53的表达。结果:1. Rb1浓度在20μmol/L-160μmol/L范围内对KG1a细胞增殖有抑制作用,呈浓度依赖性,于作用48h时抑制率达高峰(74.82%)。其IC50值为120μmol/L。2. Rgl浓度在5μmol/L-20μmol/L范围内可抑制KG1a细胞体外增殖,呈浓度依赖性,于作用48h时抑制率达高峰。抑制率最高仅为22.98%,最佳浓度为20μmol/L。3. Re对KG1a细胞增殖抑制作用不稳定。4.流式细胞术检测结果显示,与对照组比较Rbl组(120μmol/L)G2/M期KG1α细胞比例增加,S期细胞比例下降,并能提高KG1α细胞凋亡率,于作用12h时细胞即发生明显凋亡(5.15%),48h时细胞凋亡率最显著(14.79%)。5.免疫印迹法显示G-Rbl作用KG1a48 h时p38总蛋白及磷酸化的p38表达显著增加;而Erk总蛋白及其磷酸化水平上的表达均无变化;细胞内总的JNK蛋白表达变化不明显,而在其磷酸化水平则随时间延长而逐渐降低。免疫印迹法显示Rbl作用KG1a后,p53蛋白及Phosho-p53蛋白表达随时间而增加,于48h时增加最显著。结论:人参皂苷Rg1、Rb1在一定浓度范围内能抑制对KG1a细胞体外增殖,以Rb1抑制作用效果最明显,并能诱导细胞发生凋亡。Rb1抑制KG1a细胞体外增殖可能与将KG1α细胞阻滞于G2/M期有关。其可能通过影响MAPK细胞信号转导通路中p38、JNK、p53的表达与活性,从而抑制细胞增殖,促进细胞凋亡。2.人参皂苷Rb1、Re、Rg1对人红白血病细胞株K562体外增殖的影响及可能的信号转导机制目的:探讨人参皂苷Rb1、Rg1、Re对人红白血病细胞株K562增殖的影响,。并进一步阐述可能的分子机制。方法:1.实验分组:阴性对照组,常规培养;Rb1组,常规培养基础加不同浓度的Rb1(20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L、160μmol/L、320μmol/L);Rg1组,常规培养基础加不同浓度的Rg1(5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L);Re组,常规培养基础加不同浓度的Re(30μmol/L、60μmol/L、90μmol/L、120μmol/L、150μmol/L)。分别培养24h、48h、72h,收集各组细胞进行以下研究。2. MTT法检测对K562细胞体外增殖的影响,并计算细胞抑制率。3.流式细胞术检测Rb1(160μmol/L)、Rg1(20μmol/L)作用48h对细胞周期分布的影响。4. Western blotting法检测Rb1(160μmol/L)诱导不同时间后对K562细胞内p38、Erk、JNK、JAK2、STAT5及它们磷酸化水平上表达的影响。结果: 1. Rb1浓度在20μmol/L-160μmol/L范围内对K562细胞增殖有抑制作用,呈浓度依赖性,于作用48h时抑制率达高峰(39.81%)。其最适浓度为160μmol/L;Rgl浓度在5μmol/L-20μmol/L范围内对K562细胞增殖有抑制作用,呈浓度依赖性,于作用48h时抑制率达高峰(32.18%)。最佳浓度为20μmol/L。而Re对K562细胞增殖抑制作用不稳定。2.流式细胞术检测结果提示,与对照组比较Rgl组S期K562细胞比例增加,G1期细胞比例下降,而Rbl组细胞周期分布无变化。3.免疫印迹法显示Rbl各组Erk、p38、JNK和Phospho-JNK蛋白的表达无明显变化,而Phospho-Erk、Phospho-p38的表达随作用时间延长而降低。4. JAK2的表达水平随作用时间而增强,而其磷酸化水平的表达则随时间的延长降低;STAT5总蛋白的表达各组间无明显变化,但Phospho -STAT5表达则于48h时开始降低,并持续到72h。结论:人参皂苷Rg1、Rb1在一定浓度范围内能抑制对K562细胞体外增殖。Rb1可能通过抑制MAPK细胞信号转导通路中p38和Erk蛋白活性,并可能同时影响JAK2/ STAT5细胞信号通路,从而抑制K562细胞体外增殖。