毛细管电泳检测DNA的方法建立及其应用

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高效毛细管电泳(HPCE)技术,相对于大家熟知的高效液相、气相色谱而言,是一种新的分离技术,它能够分离各种分子量的物质,甚至包括蛋白质,核酸等大分子物质。分离前,将毛细管末端浸入样品瓶,在外加气压力、真空或电压作用下样品进入管内,然后待测物在高电场作用下根据其电荷量、分子大小和疏水性被分离开。依据选用毛细管类型和电解质缓冲液的不同电泳可分为几种分离模式,其中常用分离模式有毛细管区带电泳(CZE),毛细管凝胶电泳(CGE)。毛细管凝胶电泳又可分为交联毛细管凝胶电泳和无胶筛分毛细管凝胶电泳(NGE)。CZE的本质特点是整个毛细管内充盈的电泳缓冲液为均质且电场强度相同,待测物根据荷质比不同而被分离;而CGE的本质特点是毛细管中充盈交联凝胶或线性高分子溶液,将质荷比相同的待测物按其片段长短进行分离分析。 聚乙烯吡咯烷酮(PVP)是本课题的主要研究对象,本论文研究了用PVP的线性高分子溶液作为毛细管中的填充介质运用毛细管无胶筛分和毛细管动态涂渍区带电泳模式建立对DNA分子筛分和定量的方案,以此为平台对原发无精症和严重少精症病人进行Y染色体AZF区域微缺失的诊断及肿瘤病人外周血游离RNA量的间接评估。 第一部分 聚乙烯吡咯烷酮无胶筛分毛细管电泳分离DNA方法的建立 在非涂层无胶筛分毛细管电泳中,以聚乙烯吡咯烷酮为筛分介质,用pUC19DNA/Mspl(HpaⅡ)标准DNA片段为实验对象,通过调节分离缓冲液中筛分介质的浓度,电泳缓冲液的pH值,运行电压及毛细管的温度,优化出分离26bp~501bp11个DNA片段的最适条件为PVP浓度3%,电泳缓冲液的pH值7.8,运行电压—10KV,毛细管的温度25℃。聚乙烯吡咯烷酮作为筛分介质的非涂层无胶筛分毛细管电泳对于长度小于501bp的短链除了110和111bp外均获得良好的分离效果,各DNA片段不但具有良好的迁移时间重现性而且迁移时间与碱基对数目呈良好线性关系,不管是小于110bp还是110bp到501bp的短链其迁移时间与碱基对数
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