电致化学发光(Electrochemiluminescence,ECL)法结合了电化学的可控性和化学发光法的灵敏性,已经作为一种新型、高效、灵敏的分析方法成为研究热点。传统电致化学发光法通常采用单信号模式,这可能会引入来自底物和检测系统的干扰,包括微环境污染、复杂的操作步骤和电子转移动力学迟滞等因素带来的影响。为了克服来自内在背景信号的干扰,进一步提高电致化学发光法的准确度和灵敏度,近年来科学工作者已经逐渐将目标集中在双信号比率型传感模式上。在ECL过程中如果两个ECL试剂的激发电位分得足够开,就有可能实现双电位ECL比率传感。另外对ECL技术来说,由于测量的是光信号,如果光信号足够强,就可以实现可视化,直接肉眼读出,不需要额外的信号读出装置,使分析检测变得更加简单。目前很多的可视化信号都是基于一种颜色的强弱进行定量或半定量分析,但由于人眼对单色强弱的分辨率不够敏感,使检测的灵敏度不高,容易形成误判。而多色ECL分析可以解决这个问题。一般来说,多色ECL分析至少需要两个ECL发光试剂,它们具有不同的发射波长。如果两个ECL试剂的激发电位不同,那就可以用不同电压来调制混合ECL试剂的颜色。通过特殊的设计,可以使混合光颜色随着底物浓度的改变而变化,从而达到可视化检测的目的。本论文以这两种基于电位分辨的ECL比率型和多色传感模式为研究对象,结合鲁米诺、钌联吡啶、铱配合物、类石墨烯氮化碳等ECL体系,并借助双极电极(BPE)技术,构建了双电位比率传感器、双极电极空间分辨比率传感器和多色传感器及其阵列,具体开展了以下四个方面的工作:1.基于电位分辨的电致化学发光比率型癌细胞传感器本工作首先制备了 g-C3N4纳米片和Ag-PAMAM-鲁米诺纳米复合物,分别作为还原-氧化和氧化-还原ECL发光体,然后DNA探针功能化的Ag-PAMAM-鲁米诺纳米复合物与HL-60适配体杂交修饰到磁珠表面。在HL-60细胞的存在下,适配体与靶细胞进行结合,同时释放出Ag-PAMAM-鲁米诺纳米复合物。磁分离之后,释放出的Ag-PAMAM-鲁米诺纳米复合物再与捕获DNA杂交,从而连接到g-C3N4纳米片修饰的电极上。由于g-C3N4纳米片在-1.25 V vs SCE的ECL信号和Ag能够发生共振能量转移,其ECL光强被Ag-PA.MAM-鲁米诺纳米复合物有效淬灭。同时,Ag-PAMAM-鲁米诺中包被的大量鲁米诺能够在-0.5 V vs SCE发出一个ECL信号。因此,可以通过g-C3N4纳米片ECL信号的降低和鲁米诺ECL信号的增强来定量检测HL-60癌细胞的浓度,通过测量两个电位下这两者的ECL强度比值,能够实现癌细胞从200 cells/mL到9000 cells/mL的检测,检出限为 150 cells/mL(S/N=3)。2.基于双极电极的空间分辨型电致化学发光比率法用于PSA分析我们成功设计了一种基于闭合式双极电极的空间分辨型电致化学发光比率传感器,用于高灵敏检测前列腺特异抗原(PSA)。Au@g-C3N4纳米复合物作为一种ECL发光体修饰在BPE的阴极,而BPE的阳极池中加入另一种ECL发光体Ru(bpy)32+。BPE两端的电化学反应通过双极电极而偶联,它们必须同时发生并且具有相同的电子传递速率以使得电极整体呈电中性。因此,BPE一极的电化学传感反应可以在BPE的两端进行量化。通过探针DNA和PSA适配体之间的DNA杂交反应,将Pt-PAMAM-DNA酶复合材料组装在BPE的阴极。Pt-PAMAM-DNA酶复合材料通过g-C3N4和Pt-PAMAM之间的共振能量转移能够淬灭g-C3N4的发光,同时,Pt-PAMAM可以催化g-C3N4的共反应剂02的还原,因而也能实现对g-C3N4的淬灭。DNA酶能够加速O2的还原,加速对g-C3N4的淬灭。因此该Pt-PAMAM-DNA酶复合材料能够对g-C3N4实现三重淬灭。此外,Pt-PAMAM-DNA酶复合材料可以促进BPE阳极Ru(bpy)32+的电致化学发光,因为催化阴极02的还原可以增加流经BPE的法拉第电流。当在阴极池加入PSA后,PSA与电极表面的适配体结合导致Pt-PAMAM-DNA酶复合材料从电极上脱落,BPE的阴极出现ECL增强,即“off-on”的现象。相反地,在BPE的阳极,得到一种相反的ECL“on-off”现象。因此,分别采集BPE两端的ECL信号,利用两者的强度比实现了对PSA的灵敏检测,线性范围是0.10-200 ng/mL。该比率体系简单、灵敏,既不需要使用滤光片也不需要使用分光计。将ECL比率和BPE联合使用,拓宽了 BPE-ECL的应用,在临床应用中呈现出良好的发展趋势。3.基于双极电极的多色电致化学发光生物传感器铱(Ⅲ)配合物作为新型ECL试剂,通过调节它们的配体,其光谱范围可以从蓝色覆盖到红色,具有较高的量子产率。然而Ir络合物在水中的溶解度弱,限制了它们的生物应用。闭合式BPE的优点是可以将检测池与ECL报告池分开,使我们可以在两个池中使用不同的溶剂。本工作中我们使用具有不同激发电位的Ru(bpy)32+和Ir(ppy)3两种ECL发光体,其最大发射波长分别为620 nm和517 nm。将两者混合,随着外接电压的增大,ECL会从绿色到黄色再到红色变化。我们通过调节BPE的电阻,来改变BPE极点的界面电势,在阳极处观察到Ru(bpy)32+和Ir(ppy)3混合物的多色ECL发射。为了进行PSA分析,我们在BPE的间隙中构建一个由PSA浓度决定的银桥作为电阻调节器。临床认为,血清PSA小于4.0 ng/mL为正常,PSA大于10ng/mL则患前腺癌的危险性增加,患者需进行前列腺活检。通过优化条件,我们使传感器在PSA小于4.0 ng/mL显示绿色,在大于10 ng/mL是显示红色,在两者之间显示黄色和橙色。这种交通信号灯式的传感模式可快速和直观地判断PSA的浓度范围,在临床诊断方面有着很好的应用潜力。4.双向电致化学发光颜色开关在检测前列腺癌多标记物中的应用PSA在前列腺癌早期检测和防治中发挥了重要作用。然而,PSA指标具有显著的“假阳性”问题。而前列腺癌肿瘤标志群联合检测是减少假阳性的有效手段。本工作我们选择[Ir(df-ppy)2(pic)](Firpic)和Ru(bpy)32+混合物实现多色ECL。我们使用TPrA作为共反应剂时,Firpic显示出两种不同的ECL激发电位,而Ru(bpy)32+的激发电位在Firpic之间,随着外接电压的增大,混合物发射颜色呈现双向变化(蓝绿色至红色再至蓝绿色)。这种颜色变化丰富的多色ECL体系对利用多种传感策略实现多标记物的检测至关重要。我们构建了 BPE阵列电极,将PSA、miRNA-141和肌氨酸三种前列腺癌的生物标志物的检测集成在同一芯片中。三种生物标志物的浓度变化可以通过肉眼直接识别。这种装置在前列腺癌的早期诊断中具有巨大的潜力。