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猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,PRRSV）是一种正股RNA病毒,基因存在变异,严重危害世界养猪业健康发展。目前商品化PRRSV疫苗免疫保护效力有限,给我国养猪业带来了巨大损失。近20多年来,国内外学者对该病毒致病和免疫机制做了广泛研究,揭示了多种宿主拮抗蛋白分子,但PRRSV感染和致病机制尚不十分清楚,临床上尚无有效治疗药物。PRRSVGP5是该病毒编码的主要囊膜蛋白,在病毒感染、致病和免疫机制中发挥重要作用,但其与宿主蛋白的相互作用机制也不十分全面。深入研究PRRSV GP5与宿主细胞蛋白相互作用机制,研究筛选PRRSV拮抗药物及其抗病毒机制,对揭示该病毒致病机制、预防和控制该病毒感染具有重要理论意义和应用前景。本研究主要内容如下:1.GP5蛋白和宿主细胞蛋白GAPDH互作有利于PRRSV复制为了进一步明确PRRSVGP5在病毒感染和致病机制中的作用,本研究将PRRSV GP5基因真核表达质粒转染Marc-145细胞,采用免疫沉淀和串联液相色谱/质谱实验（LC-MS/MS）测定,共检测到12种可能与GP5结合的宿主蛋白。将波状蛋白（VIM）、丙酮酸激酶M2（PKM）和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）基因克隆和表达,发现GAPDH可显著提高PRRSV ORF7 mRNA表达水平和病毒滴度。通过GP5、GAPDH基因细胞转染、PRRSV感染细胞中GAPDH测定,发现PPRSV GP5与细胞质中GAPDH蛋白存在互作。根据GP5和GAPDH结构功能域,构建了 7个GP5截短体和6个GAPDH突变体,经过细胞转染和免疫共沉淀鉴定,GP5和GAPDH互作的关键位点位于GP5的第93-105个氨基酸和GAPDH的第227位赖氨酸。进一步研究证实,PPRSV感染过程中GP5与细胞质中GAPDH互作,阻止GAPDH进入细胞核。细胞质内GAPDH通过其糖酵解活性,促进PRRSV的复制,第152位的半胱氨酸是其重要活性位点。本研究初步揭示了 GAPDH在PRRSV复制过程中的作用,并提供了控制PRRSV感染的潜在靶点。2.黄腐酚抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的分子机制为了寻找PRRSV天然拮抗药物,本研究选择一种具有386种植物来源的天然药物库,采用细胞感染和免疫荧光试验,筛选获得3种具有明显拮抗PRRSV复制作用的天然药物,其中黄腐酚（Xanthohumol,Xn）表现出了较高的抑制PRRSV复制的活性。Xn在Marc-145细胞上的半数致死浓度（CC50）为62.45μM,对PRRSV的半数有效浓度（IC50）为2.37 μM,选择性指数（SI）为26.38μM。且其对PRRSV的抗病毒作用无毒株特异性,可以有效抑制经典型PRRSV毒株、高致病性毒株和类NADC-30毒株在猪肺泡巨噬细胞上的复制。药物抑制病毒复制周期的研究结果显示,Xn主要抑制PRRSV吸附和入胞,对病毒的复制和释放阶段无明显影响。利用转录组学方法检测了黄腐酚（Xn）处理的Marc-145细胞的转录组变化,GO及KEGG分析显示核因子E2相关因子2（Nrf2）抗氧化信号通路被Xn明显富集。通过荧光定量PCR方法证实,Xn可显著上调Nrf2及其下游的血红素氧合酶1（HMOX1）、谷氨酸半胱氨酸连接酶催化亚基（GCLC）、谷氨酸-半胱氨酸連接酶（GCLM）和醌NADH脱氢酶1（NQO1）等抗氧化基因。Western b1otting和荧光定量PCR等检测结果显示,PRRSV感染引起Nrf2和其下游蛋白HMOX1下调。进一步采用siRNA靶向干扰内源Nrf2基因,PRRSV复制水平得到明显提升。经Xn处理Marc-145和PAMs细胞,Nrf2和HMOX1基因表达明显上调并抑制PRRSV复制。利用siRNA靶向干扰Nrf2基因,Xn则不能有效抑制PRRSV复制。采用Xn处理Marc-145细胞,可抑制由PRRSV感染引起的氧化标志活性氧（ROS）和丙二醛（MDA）的升高和抗氧化酶超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽（GSH）的降低,表明Xn可以有效抑制由PRRSV感染引起的氧化应激。说明Xn通过上调Nrf2-HMOX1通路抑制PRRSV复制,丰富了 Xn拮抗PRRSV复制的分子机制,为抗病毒药物研发提供了理论基础。3.黄腐酚抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒感染及缓解其仔猪致病作用黄腐酚为自啤酒花提取的类黄酮类物质。本研究通过采用黄腐酚（Xn）在不同时间点处理PRRSV感染的PAMs细胞,结果显示,在感染后24h用Xn处理,仍然可以明显降低PRRSV在PAM细胞内的复制水平。同时,Xn显著抑制了由PRRSV感染引起的IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α表达水平的升高。取30～35日龄PRRSV和PCV2阴性的健康仔猪,采用高致病性PRRSV BB0907毒株进行人工感染,利用10mg/kg、20mg/kg和25 mg/kg剂量的Xn分别进行肌肉注射治疗,通过临床症状观察、病毒血症测定、病理组织学观察和炎症因子测定,观察Xn抑制PRRSV感染和治疗效果。结果为:与攻毒对照组相比,20mg/kg和25 mg/kg Xn治疗组仔猪临床症状明显较轻,第4～10d病毒血症含量和鼻拭子排毒量显著降低,第14d仔猪肺脏组织病毒载量明显降低,肺脏组织病理学变化轻微,IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α表达显著降低。证明Xn治疗能有效减轻仔猪临床症状,降低由HP-PRRSV感染引起的病毒血症,病毒排毒量、肺部病毒载量、肺部炎症反应及肺脏组织病理学变化。此外,本研究合成5种Xn衍生物,体外试验证实其中3种可显著抑制PRRSV复制,20μM的Xn衍生物可以降低50%PRRSV N蛋白表达。本研究结果表明,黄腐酚在猪体内可以显著抑制PRRSV复制并缓解其致病作用,具有重要应用前景。