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帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是黑质多巴胺神经元进行性丢失所致的神经系统变性疾病,发病率仅次于阿尔兹海默症。当多巴胺神经元损伤超过70%-80%,临床可见静止性震颤、肌强直、运动迟缓、姿势步态异常等典型症状和体征。外源性多巴胺一开始能改善多数病人的临床症状,但不能阻止疾病的进展,而且长时间服用会导致药效减退或消失。其中,左旋多巴是治疗PD最有效的药物,但长期应用可引起诸多运动并发症,其中最突出的是左旋多巴诱导的异动症(levodopa-induced dyskinesia,LID),而LID的发生机制一直不清楚。众所周知,在基底节内部,由纹状体至内侧苍白球/黑质网状部的传递有直接通路和间接通路之分。PD时,DA能神经元变性缺失,导致基底节对大脑皮质的反馈抑制作用过强而产生运动减少症状。既往研究证明在纹状体中D1受体超敏介导ERK1/2过度激活以及下游mTORC1的信号通路异常参与LID的发生被认为是LID发生的主要原因之一,这种超敏归因于异常激活的信号转导机制。既往研究证明在纹状体中D1R超敏介导ERK过度激活参与LID的发生。新近研究发现培养细胞中全新促发D1R介导ERK激活的新机制,涉及络氨酸磷酸酶Shp-2,与D1R共同调节下游信号通路。因此,本课题旨在大鼠模型中研究D1R和Shp-2之间的相互作用,明确D1R/Shp-2复合物的存在;结合D1R激动剂和拮抗剂观察D1R/Shp-2复合物在调节D1R/Shp-2/ERK1/2信号通路中的作用,以明确其在LID发生机制中所扮演的角色,并对其可能成为一个新的潜在治疗靶点提供依据。LID的发生是由于纹状体波动性的多巴胺刺激所致,已有研究表明持续性多巴胺刺激有助于减少帕金森病异动症的发生。为此,本文利用可降解生物材料聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)包裹左旋多巴/苄丝肼制作微球,均匀缓慢的释放出包裹的左旋多巴/苄丝肼,并观察微球是否影响D1R/Shp-2复合物的功能,改变Shp-2磷酸化程度,为进一步明确LID发生的机制提供实验依据。本课题共分为三个部分:第一部分:D1R与Shp-2相互作用的研究为了研究LID发生机制中D1R与Shp-2的关系,首先,我们用免疫荧光染色法显示D1R与Shp-2在纹状体细胞共定位;其次,我们用免疫共沉淀方法证实了D1R与正常大鼠纹状体神经元的Shp-2相互作用,在LID大鼠,长期波动性左旋多巴刺激不会影响D1R和Shp-2之间的相互作用。本部分结果明确了D1R/Shp-2复合物的存在。第二部分:D1R/Shp-2复合物在帕金森病大鼠LID中的作用为了继续证实D1R/Shp-2复合物的作用,本部分进一步探讨了D1R/Shp-2复合物在D1R介导的信号转导通路在LID发生中的作用。通过6-OHDA立体定向注射至SD大鼠右侧前脑内侧束建立单侧PD大鼠模型。将成功的PD大鼠模型随机分为三组,分别给予左旋多巴/苄丝肼、左旋多巴/苄丝肼+D1R拮抗剂(SCH23390)、D1R激动剂(SKF38393)治疗。在治疗期间评估不同组中的异常不自主运动(abnormal involuntary movements,AIMs)。采用免疫印迹法检测各组纹状体p-Shp-2、p-ERK1/2和p-mTOR水平。结果显示,左旋多巴/苄丝肼治疗22天后,PD大鼠出现异动症。D1R激动剂SKF38393组大鼠也出现了不同程度的异动症。相反,联合应用左旋多巴和D1R拮抗剂(SCH23390)不会引起异动症。长期应用左旋多巴或给予D1R激动剂SKF38393出现了Shp-2、ERK1/2和mTOR的过度磷酸化,而左旋多巴和D1R拮抗剂SCH23390联用未诱导这些蛋白的过度磷酸化。上述研究提示,D1R/Shp-2复合物在D1R介导的运动障碍大鼠信号转导途径中有重要作用,可能是治疗LID的潜在靶点。第三部分:左旋多巴/苄丝肼微球通过抑制D1R/Shp-2/ERK1/2信号通路异常激活缓解帕金森病大鼠异动症为了观察持续性左旋多巴对受体刺激对于大鼠纹状体D1R/Shp-2/ERK1/2信号通路的影响,本研究应用包裹左旋多巴/苄丝肼PLGA微球模拟持续性左旋多巴能刺激。通过6-OHDA立体定向注射至SD大鼠右侧前脑内侧束中建立单侧PD大鼠模型,将PD大鼠模型随机分为两组,分别给予间歇性左旋多巴刺激(LS组,给予左旋多巴/苄丝肼,一天2次)和持续性左旋多巴能刺激(continuous dopaminergic stimulation,CDS)(LBM组,给予左旋多巴/苄丝肼微球,一天1次),共21天,其中LS组包括高剂量组和低剂量组。通过AIMs评定和圆柱试验,比较两组大鼠的异动症及抗帕金森病作用。通过Western印迹法比较D1R/Shp-2/ERK1/2信号通路中关键蛋白的变化。结果显示,间断给予左旋多巴可引起6-OHDA损伤大鼠异动症,左旋多巴的抗帕金森病作用逐渐被异动症的发生所抵消。间断给予左旋多巴可增强6-OHDA损伤纹状体中膜磷酸化D1R的表达,并诱导Shp-2、Src、DARPP-32和ERK1/2的磷酸化显著增加。相比之下,CDS具有剂量依赖性的抗帕金森病作用,而不会引起明显的LID。此外,CDS不引起6-OHDA损伤纹状体Shp-2、Src、DARPP-32和ERK1/2膜D1R表达或磷酸化的改变。结果显示,微球可以通过抑制D1R/Shp-2/ERK1/2信号通路过度表达减少帕金森病大鼠LID的发生。