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工业生物技术一直试图寻找能够长久保持酶活力,并能使其循环使用的方法。酶的固定化可以满足以上的要求,但想要获得高性能的固定化酶通常需要考虑两点:即选择合适的固定化方法和寻找合适的固定化材料。基于以上两点考虑,本研究提出一种基于蛋白质纳米胶囊的新型酶固定化方式——双固定化法。首先采用原位自由基聚合技术在酶分子的表面构建聚合物外壳,形成蛋白质纳米胶囊,然后,蛋白质纳米胶囊与氧化石墨烯(GO)自组装形成双固定化酶。在这里,我们以有机磷水解酶(OPH)为酶模型,制备了有机磷水解酶酶纳米胶囊(nOPH10),再将OPH和nOPH10分别固定于GO上,形成传统固定化酶(OPH@GO)和双固定化酶(nOPH10@GO),并系统研究了固定化酶的酶学性质、催化性能与组装机理,然后基于该双固定化酶开发了有机磷农药(OPs)检测生物传感器。通过两步法完成了酶纳米胶囊的合成,先对酶表面丙烯酰化处理,再胶囊化反应得到纳米胶囊。以相对酶活为优化指标,通过单因素实验探索制备nOPHs的最佳工艺条件,最终得到nOPH10的相对酶活为97.3%。采用扫描电子显微镜(TEM)、原子力显微镜(AFM)、聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和动态光散射仪(DLS)等多种表征手段研究了 nOPH10的物化性质。与原酶OPH相比,nOPH10的粒径增加,表面带电量和电荷性质发生变化,并表现出明显不同的电泳特征。综合上述结果确认得到的酶纳米胶囊具有“壳-核”结构。采用改进的Hummers法制备GO作为固定化载体。在非共价作用力下,GO分别与OPH和nOPH1O自组装形成了 OPH@GO和nOPH10@GO。采用AFM、DLS、激光共聚焦显微镜(CLSM)和圆二色光谱(CD)等研究了固定化酶的形貌与结构,确认成功地构建了双固定化酶体系。进一步研究发现nOPH10在GO上的固载效率要高于OPH的固载效率。机理研究表明nOPH10与GO之间主要是静电力和氢键协同作用,而OPH与GO之间主要是疏水作用力。研究了固定化酶的酶学参数、催化性能与稳定性。与OPH相比,OPH@GO的酶活降低,米氏常数(Km)和催化常数(kcat)均升高,二者比值kcat/Km降低,而nOPH10@GO的上述指标均升高。热稳定性nOPH10@GO>OPH@GO>OPH;OPH,OPH@GO和nOPH10@GO维持90%以上相对酶活的pH范围分别为7.6～8.7,7.2～9.0和6.5～9.2;体积分数为20%的甲醇中,nOPH10@GO的酶活(60%)分别是OPH(20.3%)和OPH@GO(22.0%)的近三倍;nOPH10@GO冻融循环五次保留75%相对酶活,储存30天酶活未显著降低,循环使用10次保留90%以上酶活,均要优于OPH和OPH@GO。基于OPH@GO和nOPH10@GO分别构建OPs检测生物传感器OPH@GO/GCE和nOPH10@GO/GCE。以氧化峰值电流为优化指标,得到最优的固定化酶用量为6 μμL,Nafion溶液的用量为6μL。SEM表征发现OPH@GO/GCE和nOPH10@GO/GCE的表面粗糙且有许多通道。EIS测定显示,滴加固定化酶修饰后,电极的阻抗增加。进一步研究发现OPH@GO/GCE和nOPH10@GO/GCE表面的传质类型均为扩散控制,且前者的响应电流、pH适应性、精密度、重现性和储存稳定性均高于OPH@GO/GCE。这和使用不同类型的固定化酶自身催化性能和适应性能有关。