人博卡病毒(Human bocavirusl, HBoV1)是从下呼吸道感染幼儿样本中检测到的一种新细小病毒。全基因序列分析表明,该病毒与牛细小病毒(BPV)、犬细小病毒(MVC)及新发现的猪博卡病毒(PBoV),归属于细小病毒亚科博卡病毒属。众多研究表明,HBoV1在世界范围内引起儿童下呼吸道感染,患者主要是2岁以下婴幼儿,临床症状主要表现急性呼吸道哮喘和肺炎。随后另三种不同基因型HBoV2、HBoV3和HBoV4在胃肠道疾病患者的粪便中发现,表明博卡病毒不仅是呼吸道感染的病原体,还可能还会引发病毒性肠胃炎疾病。HBoV1基因全长约5.5kb,两个主要的开放阅读框分别编码非结构蛋白NS1和衣壳蛋白VP1和VP2,同时还有第三个阅读框编码非结构蛋白NP1。NP1为博卡病毒属所特有,序列高度保守,博卡病毒属成员HBoV1、BPV和MVC的NP1蛋白氨基酸序列同一性达47%。由于缺乏传统体外培养系统和动物模型,对人类博卡病毒的研究多集中于流行病学,而在HBoV1的分子生物学及病毒致病机制的研究报道甚少。因此本文主要针对HBoV1特有蛋白NP1功能展开研究,为阐明蛋白在HBoV1致病机理提供理论依据。具体研究内容包括：1.非结构蛋白NP1引起Hela细胞凋亡前期研究表明HBoV1及其病毒蛋白均不能引起A549细胞死亡。我们利用体外转染发现非结构蛋白NP1可诱导Hela细胞死亡,并且这种效应不依赖于病毒复制和其他蛋白的表达。通过形态学观察、DNA梯形条带、流式细胞术分析及caspase3活性测定阐明NP1引起的细胞死亡为凋亡。NP1诱导细胞凋亡过程中,激活caspase9而对caspase8/10活性无明显影响,并且NP1降低Bcl-2表达、上调Bax表达导致线粒体膜损伤,释放细胞色素C至胞质,阐明了NP1通过内源性途径诱导细胞凋亡。通过缺失突变NP1蛋白发现,NP1N-末端不仅在蛋白的核定位,也在诱导细胞凋亡过程中起重要作用。另外,利用流式细胞术发现在转染pNPl-EGFP的Hela细胞中发现短暂的S期和G2/M期阻滞现象。但NP1N-末端和C-末端突变蛋白都不能引起细胞周期阻滞,表明NP1是通过不同的机制诱导细胞周期阻滞和凋亡。2.非结构蛋白NP1对细胞转录因子的调控分析近期研究表明HBoV1NP1与干扰素生成过程中的重要调控因子IRF-3的DNA结合域相互作用而干扰IRF-3与IFNB启动子结合,进而抑制IFN-β的生成,揭示了NP1抑制宿主天然免疫反应及HBoV1调控宿主免疫反应的新机制。细小病毒非结构蛋白在病毒感染及引起相关疾病的过程中起至关重要的调控作用。细小病毒B19非结构蛋白NS1作为反式因子可以调控一系列转录因子和细胞因子的表达,表明非结构蛋白在B19感染引起相关疾病的过程中起到重要的作用。本实验通过双荧光素酶报告基因系统分析NP1对转录因子的调控作用,ELISA和荧光定量PCR分别从蛋白质和RNA水平检测NP1对TNF-α、IL-6表达的影响,最后利用哺乳动物双杂交系统分析NP1是否通过寡聚化发挥功能。结果表明,NP1可以调节转录因子AP-1、STAT3和STAT1的活性,但对NF-κB激活没有影响。同时,NP1对IL-6和TNF-α的细胞外分泌水平没有明显的影响,但在mRNA水平上对TNF-α的表达有一定的调节作用。NP1蛋白发挥其调节作用的功能不通过自身的二聚化来实现。3.非结构蛋白NP1核定位信号分析HBoV1非结构蛋白NP1是一个定位于细胞核的蛋白,在病毒复制及避免宿主天然免疫过程中均起重要作用。利用对NP1N末端、C末端及两端截短突变分析表明,NP1的非经典核定位信号位于7-47aa(7KDKHRSY14KRKGSPERGERKRHWQTTHHRSRSRSPIRHSGE R47),该ncNLS富含精氨酸(R)和赖氨酸(K)及丝氨酸(S),14-28aa为其双向NLS序列。通过共转染实验显示,C末端截短突变蛋白与核仁标志蛋白B23.1共定位,表明20-40aa为NP1的核仁定位信号。另外,通过关键氨基酸突变表明,NP1不含有PY-NLS,但102aa和105aa位点的脯氨酸,尤其105aa脯氨酸对于NLS起非常关键的作用。NPl核定位信号的确定有助于了解病毒蛋白在病毒感染过程中的潜在作用。4.非结构蛋白NPl与宿主细胞相互作用蛋白的筛选利用pMAL原核表达系统表达纯化融合蛋白MBP-NP1蛋白,基于T7噬菌体展示技术,筛选NP1可能相互作用的宿主蛋白。将每轮生物筛选的噬菌体进行特异性结合的噬菌体滴度测定评价NP1结合噬菌体的富集程度。经过五轮生物筛选,对不同基因大小的扩增产物进行测定,获得2个阳性克隆。利用NCBI生物信息学资源进行同源性序列分析,结果显示分别为人的Nup214和NOLC1蛋白。所得到预选蛋白为进一步深入研究NP1的生物学功能提供良好的切入点。