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目的：本研究拟通过分离大鼠原代骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)和构建骨不连大鼠模型，探究m1R-26a对含硬化蛋白域蛋白1(sclerostindomain-containing protein 1，SOSTDCl)的调控机制，分析对间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)的成骨分化、软骨形成和抑制破骨细胞活化的影响等，同时观察对比骨不连大鼠配合使用中药治疗所取得的效果。
方法：①骨不连动物模型建立：选取6周健康SD大鼠分为对照组和骨不连组，每组6只。所有大鼠在股骨中段进行截骨手术，骨不连组大鼠将骨折断端周围骨膜尽可能剥除，对照组动物只进行骨折手术，不剥除骨膜。术后2、4、8周进行X线摄片，术后8周处死所有大鼠，留取血清，截取骨折处的骨组织，Real-timePCR检测血清及骨组织中m1R-26a表达水平；Westernblot检测SOSTDC1、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、骨钙素(osteocalcin，OC)表达水平。②合成m1R-26a的mlmics组及NC组对照；与第一部分同种属的大鼠，取股骨，分离BMSCs，并对细胞进行鉴定；BMSCs转染m1R-26amlmics或NC，转染完换液时换成成骨分化培养基培养7天进行成骨诱导；转染后36hReal-timePCR检测m1R-26a表达水平；成骨诱导7天后Westernblot检测SOSTDC1，ALP，OC表达水平。⑧构建含有m1R-26a靶定的SOSTDC13UTR区域的荧光报告载体及含有突变序列的载体，与m1R-26amimics或其NC共转进工具细胞，检测荧光值；(分组：UTR+NC,UTR+m1R-26amimics,UTR-mut+NC,UTR-mut+m1R-26amimics)；将m1R-26amlmics或NC转染进BMSCs，48h提取蛋白质，Westernblot检测SOSTDC1表达水平。④第一部分相同种属大鼠，分成对照组、骨不连组、骨不连+NC组、骨不连+m1R-26amlmics组，建模方法同前，对照组只进行骨折，不剥除骨膜，术后在骨折部位注射m1R-26amimics或NC，每只每次将15μgRNA溶于50μlPBS中，每周注射一次，共注射8周：术后2，4，8周分别用X光对骨折部位进行照相，观察骨折愈合情况；术后8周处死大鼠，留取血清和骨折处骨组织；Real-timePCR检测血清和骨组织中m1R-26a表达水平；Westernblot检测骨组织中ALP，OC表达水平；Westernblot检测SOSTDC1，GSK3β，p-GSK3β(Ser9)，及胞核内B-catenin表达水平。⑤第一部分相同种属大鼠，分成骨不连组、骨不连+中药组，建模方法同前，中药组大鼠术后给予中药灌胃，每次1ml，每天1次，共8周；术后2，4，8周分别用X光对骨折部位进行照相，观察骨折愈合情况；术后8周处死大鼠，留取血清和骨折处骨组织；Real-timePCR检测血清和骨组织中m1R-26a表达水平；Westernblot检测骨组织中ALP，OC表达水平；Westernblot检测SOSTDC1，GSK3β，p-GSK3β(Ser9)，及胞核内β-catenin表达水平。
结果：通过实验检测了大鼠术后8周血清和骨组织中m1R-26a的表达水平，与对照组相比，骨不连组大鼠中的m1R-26a表达水平明显下降；同时还检测了骨组织中SOSTDC1、ALP和OC的蛋白水平，结果显示骨不连组大鼠中SOSTDC1表达明显升高，ALP、OC表达水平较对照组明显降低，说明骨折愈合不良；骨不连+中药组与骨不连组相比，SOSTDC1表达水平降低，而ALP、OC表达水平升高。结果表明SOSTDC1可能是m1R-26a下游的靶基因；m1R-26a在BMSCs中高表达，可以有效促进成骨分化，促进骨愈合；结合中药仙灵骨葆胶囊治疗效果更加明显。
结论：SOSTDC1可能作为m1R-26a的靶基因与骨不连的发生密切相关，m1R-26a能够促进间充质干细胞的成骨化，进一步促进骨愈合。同时通过实验表明配合中药仙灵骨葆胶囊治疗可进一步加速骨不连大鼠骨愈合。
方法：①骨不连动物模型建立：选取6周健康SD大鼠分为对照组和骨不连组，每组6只。所有大鼠在股骨中段进行截骨手术，骨不连组大鼠将骨折断端周围骨膜尽可能剥除，对照组动物只进行骨折手术，不剥除骨膜。术后2、4、8周进行X线摄片，术后8周处死所有大鼠，留取血清，截取骨折处的骨组织，Real-timePCR检测血清及骨组织中m1R-26a表达水平；Westernblot检测SOSTDC1、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、骨钙素(osteocalcin，OC)表达水平。②合成m1R-26a的mlmics组及NC组对照；与第一部分同种属的大鼠，取股骨，分离BMSCs，并对细胞进行鉴定；BMSCs转染m1R-26amlmics或NC，转染完换液时换成成骨分化培养基培养7天进行成骨诱导；转染后36hReal-timePCR检测m1R-26a表达水平；成骨诱导7天后Westernblot检测SOSTDC1，ALP，OC表达水平。⑧构建含有m1R-26a靶定的SOSTDC13UTR区域的荧光报告载体及含有突变序列的载体，与m1R-26amimics或其NC共转进工具细胞，检测荧光值；(分组：UTR+NC,UTR+m1R-26amimics,UTR-mut+NC,UTR-mut+m1R-26amimics)；将m1R-26amlmics或NC转染进BMSCs，48h提取蛋白质，Westernblot检测SOSTDC1表达水平。④第一部分相同种属大鼠，分成对照组、骨不连组、骨不连+NC组、骨不连+m1R-26amlmics组，建模方法同前，对照组只进行骨折，不剥除骨膜，术后在骨折部位注射m1R-26amimics或NC，每只每次将15μgRNA溶于50μlPBS中，每周注射一次，共注射8周：术后2，4，8周分别用X光对骨折部位进行照相，观察骨折愈合情况；术后8周处死大鼠，留取血清和骨折处骨组织；Real-timePCR检测血清和骨组织中m1R-26a表达水平；Westernblot检测骨组织中ALP，OC表达水平；Westernblot检测SOSTDC1，GSK3β，p-GSK3β(Ser9)，及胞核内B-catenin表达水平。⑤第一部分相同种属大鼠，分成骨不连组、骨不连+中药组，建模方法同前，中药组大鼠术后给予中药灌胃，每次1ml，每天1次，共8周；术后2，4，8周分别用X光对骨折部位进行照相，观察骨折愈合情况；术后8周处死大鼠，留取血清和骨折处骨组织；Real-timePCR检测血清和骨组织中m1R-26a表达水平；Westernblot检测骨组织中ALP，OC表达水平；Westernblot检测SOSTDC1，GSK3β，p-GSK3β(Ser9)，及胞核内β-catenin表达水平。
结果：通过实验检测了大鼠术后8周血清和骨组织中m1R-26a的表达水平，与对照组相比，骨不连组大鼠中的m1R-26a表达水平明显下降；同时还检测了骨组织中SOSTDC1、ALP和OC的蛋白水平，结果显示骨不连组大鼠中SOSTDC1表达明显升高，ALP、OC表达水平较对照组明显降低，说明骨折愈合不良；骨不连+中药组与骨不连组相比，SOSTDC1表达水平降低，而ALP、OC表达水平升高。结果表明SOSTDC1可能是m1R-26a下游的靶基因；m1R-26a在BMSCs中高表达，可以有效促进成骨分化，促进骨愈合；结合中药仙灵骨葆胶囊治疗效果更加明显。
结论：SOSTDC1可能作为m1R-26a的靶基因与骨不连的发生密切相关，m1R-26a能够促进间充质干细胞的成骨化，进一步促进骨愈合。同时通过实验表明配合中药仙灵骨葆胶囊治疗可进一步加速骨不连大鼠骨愈合。