一、立题依据和目的 NK细胞是机体免疫系统抗肿瘤和病毒感染的第一道防线。在人类，NK细胞能有效的杀伤HLA-Ⅰ类分子表达减少或缺失的异常细胞。肿瘤或病毒感染常会使HLA-Ⅰ类分子表达下调，因而肿瘤或病毒感染细胞能被杀伤和裂解。NK细胞识别正常细胞和HLA-Ⅰ类分子的能力是由于克隆性分布的HLA-Ⅰ类分子特异的抑制性受体的表达，通过募集特异性磷酸酶(SHP-1和SHP-2)阻断活化信号转导，从而抑制NK细胞介导的细胞毒作用。所有抑制性受体的一般结构特性是由它们胞浆内免疫受体酪氨酸抑制基序(ImmunoreceptorTyrosine-basedInhibitingMotifs,ITIM)决定的。抑制性受体分属两种不同的受体家族，免疫球蛋白超家族(Ig-SF)和C型凝集素超家族。不同的杀伤抑制性受体(KIR)都属于Ig-SF,它们特异性识别不同的HLA-Ⅰ类等位基因群。KIR的编码基因定位于19号染色体长臂19q13.42一个叫作白细胞受体复合体(LeukocyteReceptorComplex,LRC)的区域[6，7]。CD94/NKG2A异二聚体属于C型凝集素家族抑制性受体，它特异性识别非经典HLA-Ⅰ类分子HLA-E，CD94/NKG2A编码基因定位于12号染色体长臂12q12-13一个称为NK基因复合体的区域。 重要的是，HLA-Ⅰ类分子特异的抑制性受体通过竞争性下调不同活化受体的功能阻断NK细胞介导的细胞毒作用。直到最近几年，负责使NK细胞活化的活化受体才得到定义和分子阐明，主要包括活化杀伤细胞免疫球蛋白样受体(Killerimmunogloblin-likereceptors，KIRs)、自然细胞毒受体(Naturalcytotoxicityreceptors,NCRs)和一些协同活化受体。活化KIRs是HLA-Ⅰ类分子特异的活化受体，对HLA-Ⅰ类分子阴性的靶细胞的裂解不起作用。自然细胞毒受体包括NKp46、NKp30、NKp44，它们只表达于NK细胞，因此它们是识别NK细胞的最准确标志。另外一个在NK介导的对一些肿瘤的裂解和细胞毒作用中起作用的表面受体是NKG2D—属于NKG2家族的细胞表面受体(以含有凝集素样区域为特征的Ⅱ型膜蛋白)。NKG2D也表达于T细胞亚群，是压力诱导的MICA/B或ULBP蛋白特异的。NK细胞表达的别的活化表面分子好象主要作为协同受体起作用。包括2B4、NTB-A、NKp80、CD59和DNAM-1。DNAM-1配体已经鉴定包括脊髓灰质炎病毒受体(PVR，CD155)和Nectin-2(CD112)(也就是说，凝集素家族的两个成员也参与了细胞间的黏附和粒/淋巴细胞的渗出)。 NK细胞表达的三个直接参与自然细胞毒作用的受体，统称为NCRs。NCRs的共同特征是它们选择性表达于NK细胞并以HLA-Ⅰ类分子非依赖的方式诱导NK细胞活化。另外，用单克隆抗体干扰NCR和配体的识别可导致自然杀伤作用的抑制。另外一个重要的特征是在生理情况下，NCR诱导的NK细胞活化受HLA-Ⅰ类分子特异的抑制性受体的负调节。很显然目前为止所识别的NCR在NK细胞杀伤不同类型的肿瘤靶细胞中起着协同促进作用。这证实自然杀伤作用是NK细胞和靶细胞之间的多种受体和配体之间相互作用的结果。尽管NCRs识别的分子配体还没有识别，已经有描述NKp46和NKp44识别流感病毒血凝素和副流感病毒血凝素神经酰胺酶病毒蛋白。 NKp46是第一个识别的NCR，它选择性的表达于所有静息和活化的NK细胞。它代表自然杀伤(有关)的主要受体，它的单克隆抗体介导的交联会诱导Ca2+动员和细胞因子释放。NKp46参与不同靶细胞的裂解，包括同系、同种和异种起源的正常和肿瘤细胞。特别的是，(发现)NKp46参与NK介导的对大多数人类肿瘤细胞的杀伤作用，这些肿瘤细胞分属不同的组织类型包括肺癌、肝癌、乳腺癌、黑色素瘤和EBV感染细胞株。NKp46在不同的NK细胞和不同的个体表达量不同。NK介导的细胞毒作用的重要性与NKp46在细胞表面的表达水平高低有关，暗示NKp46在自然杀伤作用中起着关键作用。NKp46以胞外区有两个C2型免疫球蛋白样结构域为特征，跨膜区含有精氨酸残基，与CD3ζ和FcεRIγ相连，与受体结合后会出现酪氨酸磷酸化，启动信号传导。NKp46的编码基因定位于人染色体19q13.42称为淋巴细胞受体复合体的区域，KIR多基因家族端粒区，NKp46基因也存在于啮齿类和灵长类。 NKp30与NKp46有一些共同的特征。特别的是，NKp30选择性的表达于静息或活化的NK细胞，单克隆抗体介导的交联诱导Ca2+流动，产生杀伤作用和产生细胞因子。NKp30是一个分子量为30KD的糖蛋白，属于Ig-SF，胞外区有一个与CD3ζ多肽相连的IgV样区域。并且跨膜区含有精氨酸残基。NKp30通过与CD3ζ链结合传递激活信号。NKp30基因定位于人染色体6p21.32，在LTB(淋巴毒素-β或TNF超家族成员-3)和AIF1(同种异体炎症因子1)基因之间的HLA-Ⅲ类分子的端粒区。NKp30基因也存在与短尾猿和大鼠，而在小鼠只鉴定发现了其假基因。 与NKp46和NKp30受体不同的是，NKp44选择性的表达于IL-2活化的NK细胞，因此是活化NK细胞的最佳表面标志。这揭示活化NK细胞比静息NK细胞的杀伤作用强可能与NKp44有关。NKp44是另外一个像NKp30一样的Ig-SF成员，胞外区含有一个IgV样结构。跨膜区含有带电酪氨酸残基，可能参与NKp44与KARAP/DAP12多肽的结合。编码NKp44的基因定位于人染色体6p21.1，与TREM-1和TREM-2基因临近，这两个基因编码与KARAP/DAP12分子相连的受体，分别表达于嗜中性粒细胞和单核细胞或巨噬细胞和树突状细胞。与别的NCRs不同，到目前为止NKp44的同源基因还没有在与人不同的其它物种发现。 尽管有关NK细胞受体的很多主要问题在最近几年已经得到解决，为了更好的了解NK细胞的生理功能，还有很多相关的问题需要解决。一个主要的问题是关于这些活化受体和协同活化受体的分子配体的鉴定。应用受体特异性的配体来增强NK细胞的杀伤活性，很可能会为肿瘤等疾病的生物治疗提供一条新途径。要进一步研究发现人NCRs等杀伤细胞受体的相关配体，需要认识NK细胞受体的结构及其识别特异性，从分子水平了解NK细胞生物学功能的发挥。本课题就是以此为思路，为寻找NKp30的分子配体，我们采用基因工程的一系列实验方法设计人NKp30的基因克隆并成功构建了其重组真核表达载体，为寻找相应配体及进一步研究其生物学功能打下了基础。 二、方法和结果 1.人NKp30基因克隆及序列分析 根据GeneBank报道的人NKp30基因序列，设计扩增人NKp30基因的上、下游引物，分别在5端加上限制性酶切位点XhoI和EcoRI。 取正常人新鲜外周血，用本室配置RNA纯化试剂盒分离纯化细胞总RNA。以RNA为模板，随机六聚体核苷酸为引物，在M-MLV逆转录酶作用下进行反应，合成cDNA第一条链。 取逆转录产物为模板，用设计的NKp30基因上、下游引物和TaqDNA聚合酶进行PCR扩增人NKp30基因。用低熔点琼脂糖凝胶电泳分离纯化PCR扩增产物后，与pMD18-T载体连接，转化入大肠杆菌DH5α，接种于含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养平板上。用菌落PCR和限制性酶谱分析筛选出阳性克隆。采用ABI3100-AvantGeneticAnalyzer基因分析仪进行测序，结果显示，克隆的基因和预期的人NKp30基因序列相差一个碱基但并不影响其表达，成功构建了人NKp30重组质粒pMD18-NKp30。 2.人NKp30基因真核表达载体的构建及其在COS7细胞中的表达 用XhoI和EcoRI分别双酶切重组载体pMD18-T-NKp30和pIRES2-EGFP，再用1％琼脂糖凝胶电泳分离纯化，获得目的基因片段NKp30及线性载体。利用T4DNA连接酶将基因片段NKp30与酶切处理载体pIRES2-EGFP连接，构建表达重组子pIRES2-EGFP-NKp30。 将连接产物转化入大肠杆菌感受态细胞DH5α，然后接种于含有卡那霉素的LB培养平板上37℃过夜培养。利用菌落PCR，初步筛选阳性重组子。挑选阳性克隆，接种于含有100ug/ml卡那霉素的LB培养液37°C摇床过夜培养。采用树脂法小量提取质粒，然后用XhoI和EcoRI双酶切鉴定。 取鉴定正确的pIRES2-EGFP/hNKp30，PEG纯化法中量提取质粒DNA，DU640分光光度计测定DNA浓度备用。采用体外电穿孔法转染COS-7细胞，37℃，5％CO2条件下培养48h，荧光显微镜下观察可见到大量绿色荧光，说明转染成功，重组质粒得到了很好的表达。抽提细胞总RNA，RT-PCR检测可见NKp30mRNA的表达。 三、结论 1.成功克隆了人NKp30基因，序列分析显示，克隆的基因序列和文献报道一致。 2.成功构建了人NKp30的真核表达载体并在真核细胞中获得了有效表达。